MEDIOS DE ESTABILIZACIÓN Y DE SEPARACIÓN PARA APLICACIONES DE ELECTROFORESIS.

Método para la separación de analitos mediante electroforesis de flujo libre,

donde la electroforesis de flujo libre selleva a cabo con:

un medio de separación binario que contiene un ácido tampón y una base tampón, donde el valor de pKa delácido tampón es mayor que el valor de pH del medio de separación, y donde el valor de pKa de la base tampónes menor que el valor de pKa del medio de separación; y caracterizado por

un medio de estabilización catódico que comprende al menos un ácido tampón y al menos una base fuerte;un medio de estabilización anódico que comprende al menos una base tampón y al menos un ácido fuerte;donde el medio de estabilización anódico y catódico tienen una conductividad mayor que el medio de separación,evitando de ese modo la contaminación cruzada entre el área de separación y el compartimento del electrodo deldispositivo de electroforesis

y

donde el pH del medio de separación durante la electroforesis es prácticamente constante, o donde la diferenciade pH entre el lado anódico y el lado católico está entre aproximadamente 0,2 y 3 unidades de pH durante laelectroforesis.

Medios de estabilización y de separación para aplicaciones de electroforesis

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a la electroforesis de flujo libre (Free Flow Electrophoresis, FFE) que se emplea para la separación de analitos tales como biopartículas en una muestra. Más específicamente, la presente invención descrita en la presente memoria se refiere a medios de separación así como a medios de estabilización usados para llevar a cabo electroforesis de flujo libre.

Antecedentes de la invención [0002] La electroforesis es una tecnología bien establecida para la separación de partículas basada en la migración de partículas cargadas bajo la influencia de una corriente eléctrica continua. Se han desarrollado varios modos de operación diferentes tales como isoelectroenfoque (IsoElectric Focusing, IEF) , isotacoforesis (IsoTachoPhoresis, ITP) , y electroforesis de zona (Zone Electrophoresis, ZE) como variantes el principio de separación anterior y se conocen generalmente por los expertos en la materia.

La electroforesis por isoelectroenfoque (IEF) es una técnica empleada habitualmente, por ejemplo, en la caracterización de proteínas como mecanismo para determinar el punto isoeléctrico de la proteína (véase, por ejemplo, Analytical Biochemistr y . Addison Wesley Longman Tercera Edición Limitada, 1998) .

La isotacoforesis es una tecnología basada en un principio descrito en 1920. En esta técnica el electrolito entre los electrodos no es una única solución uniforme sino una secuencia discontinua de diferentes soluciones de electrolitos, los iones de las cuales migran todos a la misma velocidad. En condiciones idénticas de concentración y tensión, los iones diferentes tienen movilidades electroforéticas diferentes. Para causar que todos los iones se muevan a la misma velocidad se requiere un gradiente de tensión diferente para cada grupo de iones. El gradiente diferente se desarrolla espontáneamente durante el procedimiento de electroforesis. En la práctica, esta es una técnica de enfoque basada en la migración de los componentes de la muestra entre los electrolitos líder y terminador. Los solutos que tienen movilidades intermedias entre las de los electrolitos líder y terminador se apilan en zonas enfocadas y definidas (Analytical Biochemistr y . Addison Wesley Longman Tercera Edición Limitada, 1998) . Un ejemplo típico de las aplicaciones electroforéticas que pueden operar en el modo de isotacoforesis es la denominada electroforesis capilar.

La electroforesis de zona es otro modo de operación bien conocido. La electroforesis de zona se basa en la diferencia entre el valor de movilidad electroforética de las partículas que se van a separar y del medio de separación empleado. La electroforesis de zona hace posible el aislamiento de analitos y partículas en base a la diferencia de tamaño y/o forma y/o carga superficial neta. Para la puesta en práctica satisfactoria de la electroforesis de zona es importante la homogeneidad (pH constante) de la solución de separación y de la intensidad del campo constante a través de toda la zona de separación.

Los modos de operación generales mencionados anteriormente se pueden aplicar a varias tecnologías electroforéticas diferentes tales como electroforesis sobre soporte sólido (tal como papel de filtro, acetato de celulosa, agarosa, etc.) , electroforesis capilar y electroforesis de flujo libre (FFE) .

Entre todas las tecnologías electroforéticas, la electroforesis de flujo libre (FFE) es una de las más prometedoras [Krivanova L. y Bocek P. (1998) , "Continuous free-flow electrophoresis", Electrophoresis 19: 1064-1074]. La FEE es una tecnología en la cual la separación de los analitos se produce en un medio líquido en ausencia de una fase estacionaria (o de un material de soporte sólido) para minimizar la pérdida de muestra por absorción. La FFE se denomina a menudo electroforesis de deflexión sin portador o electroforesis de deflexión libre de matriz.

En el campo de la proteómica, la FFE es la tecnología de elección para la separación previa definida de muestras de proteínas complejas en términos de sus valores variables de pI (punto isoeléctrico) . Usando la FFE, se pueden separar biopartículas tales como células en base a la movilidad electroforética de las células. Los principios 55 correspondientes ya se han descrito [por ejemplo, Bondy B., Bauer J., Seuffert I. y Weber G. (1995) , "Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97], pero la FFE ha recibido poco reconocimiento dado que la mayoría de los tipos celulares difieren solo mínimamente en términos de su carga superficial, haciendo difícil la separación de estos tipos celulares. Uno de los primeros refinamientos fue la introducción de la inmuno-FFE que permitió la unión de anticuerpos específicos a epítopos de superficie específicos de las células que se iban a separar, haciendo posible modificar la movilidad electroforética de estas células en la FFE al modificar la carga neta de la superficie celular [por ejemplo, Hansen E. y Hannig K. (1982) , "Antigen-specific electrophoretic cell separation (ASECS) : Isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophoresis after reaction with antibodies", J. Immunol. Methods 11, 51: 197-208].

El procedimiento de FFE se ha mejorado, por ejemplo, a través de medios de estabilización y medios de contracorriente. Esto se refleja, por ejemplo, en la patente US 5.275.706. Según esta patente, se introduce un medio de contracorriente en el espacio de separación en contra de la dirección de flujo continuo del medio de separación neto y la muestra que se desplaza entre los electrodos. Ambos medios (los medios de separación y los medios de contracorriente) se descargan o se eluyen a través de salidas de fraccionamiento, típicamente en una placa de microtitulación, resultando en un procedimiento de fraccionamiento que tiene un bajo volumen muerto. Además, se mantiene un flujo laminar de los medios en la región de las salidas de fraccionamiento.

Una técnica de FFE particular denominada FFE de intervalo se desvela, por ejemplo, en la patente US

6.328.868. En esta patente, se introducen tanto la muestra como el medio de separación en una cámara de electroforesis, y a continuación se separan usando un modo de electroforesis tal como electroforesis de zona, isotacoforesis, o isoelectroenfoque y, finalmente, se expulsan de la cámara a través de salidas de fraccionamiento. Las realizaciones de la patente US 6.328.868 describen que el movimiento de los medios de separación y de la muestra son unidireccionales, desplazándose desde el extremo de entrada hacia el extremo de salida de la cámara, aplicándose una tensión efectiva que hace que se produzca la migración electroforética, mientras que la muestra y los medios no se conducen hidráulicamente desde el extremo de entrada hacia el extremo de salida, a diferencia de la técnica usada habitualmente en la técnica, en la cual la muestra y los medios pasan a través del aparato mientras se separan en un campo eléctrico (FFE continúa) .

La Solicitud de Patente Internacional WO 02/50524 desvela un método de electroforesis que emplea un aparato con una cámara de separación a través de la cual fluye el medio de separación y que proporciona un espacio de separación definido por un fondo y una cubierta, y espaciadores que separan al uno del otro. Además, este aparato de FFE incluye una bomba para suministrar el medio de separación que entra en la cámara de separación a través de líneas de alimentación de medio y abandona la cámara a través de las salidas. El aparato de FFE también incluye electrodos para aplicar un campo eléctrico dentro del medio de separación y puntos de inyección de muestra para la adición de la mezcla de partículas o analitos y puntos de fraccionamiento para eliminar las partículas separadas mediante FFE en el medio de separación. Las partículas separadas se pueden usar para fines analíticos o para un procesamiento preparativo adicional.

Se conocen en la técnica una diversidad de medios de separación para la separación de analitos tales como biopartículas y biopolímeros. Por ejemplo, en el libro "Free-flow Electrophoresis", publicado por K. Hannig e IC. H. Heidrich, (ISBN 3-921956-88-9) se publica una lista de medios de separación adecuados para FFE y en particular para FFE de Zona. Todos los medios desvelados en el mismo contienen bases, cuyos valores de pKa son mayores que los valores de pKa de los ácidos usados para el ajuste del pH de los medios de separación finales. Sin embargo, en los medios de separación de la técnica anterior, se observa a menudo... [Seguir leyendo]

1. Método para la separación de analitos mediante electroforesis de flujo libre, donde la electroforesis de flujo libre se lleva a cabo con:

un medio de separación binario que contiene un ácido tampón y una base tampón, donde el valor de pKa del ácido tampón es mayor que el valor de pH del medio de separación, y donde el valor de pKa de la base tampón es menor que el valor de pKa del medio de separación; y caracterizado por un medio de estabilización catódico que comprende al menos un ácido tampón y al menos una base fuerte; un medio de estabilización anódico que comprende al menos una base tampón y al menos un ácido fuerte; donde el medio de estabilización anódico y catódico tienen una conductividad mayor que el medio de separación, evitando de ese modo la contaminación cruzada entre el área de separación y el compartimento del electrodo del dispositivo de electroforesis y donde el pH del medio de separación durante la electroforesis es prácticamente constante, o donde la diferencia de pH entre el lado anódico y el lado católico está entre aproximadamente 0, 2 y 3 unidades de pH durante la electroforesis.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medio de separación se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

el valor de pKa del ácido tampón es de aproximadamente 0, 2 a aproximadamente 2 unidades, preferentemente de 0, 4 a 0, 9 unidades mayor que el valor de pH del medio de separación; el valor de pKa de la base tampón es de aproximadamente 0, 2 a aproximadamente 2 unidades, preferentemente de 0, 4 a 0, 9 unidades menor que el valor de pH del medio de separación; la diferencia entre el valor de pH máximo y mínimo del medio de separación durante la electroforesis es más de aproximadamente 0, 2 y menos de 3 unidades de pH, preferentemente donde la diferencia de pH está entre 0, 5 y 2 unidades de pH, y más preferentemente entre 0, 5 y 1, 5 unidades de pH; la diferencia entre el valor de pKa del ácido tampón y el valor de pKa de la base tampón (∆pKa) está entre aproximadamente 0, 5 y aproximadamente 4, 0, preferentemente entre 0, 8 y 2, 5 y más preferentemente entre 1, 2 y 1, 8, o donde la diferencia entre el valor de pKa del ácido tampón y el valor de pKa de la base tampón (∆pKa) está entre aproximadamente 2, 5 y 4 y preferentemente entre aproximadamente 2, 5 y 3, 3; el ácido tampón se selecciona entre sustancias tampón biológicamente aceptables, preferentemente se selecciona entre el grupo que consiste en HIBA, ácido acético, ácido picolínico, PES, MES, ACES, MOPS, HEPES, EPPS, TAPS, AMPSO, CAPSO, α-alanina, GABA, EACA, 4-hidroxipiridina, y 2-hidroxipiridina; la base tampón se selecciona entre sustancias tampón biológicamente aceptables; preferentemente se selecciona entre el grupo que consiste en taurina, glicina, ácido 2-aminobutírico, glicilglicina, β-alanina, GABA, EACA, creatinina, piridina-etanol, piridina-propanol, histidina, BISTRIS, morfolinoetanol, trietanolamina, TRIS, amediol, bencilamina, dietilaminoetanol, trialquilaminas; y el medio de separación comprende además uno o más de un aditivo, donde los aditivos se seleccionan preferentemente entre otros ácidos y/o bases, aniones y cationes mono y divalentes esenciales, potenciadores de la viscosidad, detergentes, agentes de solubilización de proteínas, ligandos de afinidad y agentes reductores, más preferentemente donde el aditivo se selecciona entre el grupo que consiste en tiourea, urea, derivados poliméricos hidrofílicos, tales como HPMC, PEGs, polialcoholes, tales como glicerol, hidratos de carbono tales como sacarosa, selectores quirales tales como dextrinas, o ciclodextrinas, lectinas, mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) , iones calcio, iones magnesio, iones cinc, iones cloruro, iones sulfato, EDTA, EGTA, y azida.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho medio de separación se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

la relación de concentración entre el ácido tampón y la base tampón varía de aproximadamente 9:1 para la fracción más cercana al ánodo a aproximadamente 1:9 para la fracción más cercana al cátodo, donde preferentemente las concentraciones del ácido tampón y de la base tampón en el medio de separación son aproximadamente iguales; dicho medio de separación consiste en de al menos 2 a aproximadamente 15 fracciones separadas que comprenden concentraciones variables del ácido tampón y de la base tampón para proporcionar un gradiente de pH preformado, preferentemente donde dicho medio de separación comprende de 4 a 10 fracciones separadas; la concentración del ácido tampón e, independientemente entre sí, de la base tampón en el medio de separación es ≥ 5 mM, y preferentemente ≥ 10 mM, más preferentemente ≥ 20 mM, lo más preferentemente ≥ 50 mM; y la conductividad del medio de separación está entre aproximadamente 30 y 1000 μS/cm, o entre aproximadamente 50 y 500 μS/cm, o entre aproximadamente 50 y 400 μS/cm, preferentemente entre aproximadamente 50 y 200 μS/cm, y más preferentemente entre aproximadamente 50 y 150 μS/cm.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho medio de estabilización catódico para electroforesis se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

la concentración de la al menos una base fuerte del medio es suficiente para conseguir una desprotonación substancial de todos los ácidos usados en el medio de estabilización, preferentemente donde la relación de concentración entre el ácido o ácidos y la base o bases del medio de estabilización (relación de ácido o ácidos/base o bases) es al menos > 1, pero < 50, preferentemente donde la relación de concentración está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10; y el pH del medio de estabilización catódico es mayor que el pH del medio de separación; preferentemente donde el ácido tampón se selecciona entre ácidos o compuestos anfotéricos, con la condición de que el pKa de la función de base en el compuesto anfotérico sea al menos 3 unidades menor que el pKa de la función de ácido, donde la función de ácido tiene un pKa entre aproximadamente 3 y 13, más preferentemente donde dicho ácido tampón se selecciona entre el grupo que consiste en HIBA, ácido acético, ácido picolínico, PES, MES, ACES, MOPS, HEPES, EPPS, TAPS, AMPSO, CAPSO, α-alanina, GABA, EACA, 4-hidroxipiridina, y 2-hidroxipiridina; y/o la base fuerte se selecciona entre un hidróxido de metal alcalino, un hidróxido de metal alcalinotérreo y otras bases que tienen un pKa que es al menos 3 unidades de pK mayor que el pKa del ácido tampón de dicho medio.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho medio de estabilización catódico para electroforesis se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

el medio de estabilización catódico comprende además al menos una base tampón, con la condición de que la concentración de todos los ácidos en dicho medio sea mayor que la concentración de todas las bases; el pKa de cada ácido tampón del medio de estabilización es igual o mayor que el pKa de cada ácido tampón usado en el medio de separación; el ∆pKa entre el ácido tampón del medio de estabilización y el ácido tampón del medio de separación es menor que 1, preferentemente menor que 0, 5; al menos un ácido tampón de dicho medio de estabilización tiene una movilidad electroforética y un pKa similar al ácido tampón usado en el medio de separación; y al menos un ácido tampón del medio de estabilización es idéntico al ácido tampón usado en el medio de separación.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el pKa de cada uno de los ácidos tampón en dicho medio de estabilización catódico es mayor que el pI del analito más alcalino de la muestra que se va a separar; y, opcionalmente, donde dicho medio de estabilización se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

dicho medio de estabilización contiene más de un ácido tampón, preferentemente donde dicho medio de estabilización contiene al menos 2 o al menos 3 ácidos tampón; dicho medio de estabilización contiene además más de una base tampón; el valor de pKa de cada uno de los ácidos tampón del medio de estabilización es mayor que el valor de pH máximo del medio de separación, preferentemente donde el pKa de cada uno de los ácidos tampón del medio de estabilización está dentro del intervalo (pI + 0, 3) < pKa < (pI + 3) , preferentemente dentro del intervalo (pI + 0, 5) < pKa < (pI + 2) , y lo más preferentemente dentro del intervalo (pI + 0, 5) < pKa < (pI + 1, 3) ; el valor de pKa de cada ácido tampón está en el intervalo de (pHmax + 0, 3) < pKa < (pHmax + 3) , preferentemente dentro del intervalo (pHmax + 0, 5) < pKa < (pHmax + 2) , y lo más preferentemente dentro del intervalo (pHmax + 0, 5) < pKa < (pHmax + 1, 3) ; el pH del medio de estabilización es mayor que el pH máximo del medio de separación, preferentemente donde el pH del medio de estabilización catódico no excede del pH máximo del medio de separación en más de aproximadamente 2 unidades de pH; la concentración de los ácidos tampón que tienen un mayor pKa (ácidos débiles) en dicho medio de estabilización catódico está aumentada con respecto a la concentración del ácido tampón que tiene el menor pKa (ácido tampón más fuerte) , preferentemente, donde la concentración de los ácidos más débiles está aumentada en un factor de al menos aproximadamente 2, y más preferentemente en un factor de al menos aproximadamente tres con respecto a la concentración del ácido tampón más fuerte de dicho medio; la concentración total de los ácidos tampón en dicho medio de estabilización catódico es de aproximadamente 1, 1 a 50 veces, preferentemente de aproximadamente 2 a 20 veces, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 a 15 veces mayor que la concentración del ácido tampón en el medio de separación, la concentración total de todos los ácidos tampón en el medio de estabilización es mayor de aproximadamente 20 mM, preferentemente mayor de aproximadamente 50 mM, y lo más preferentemente mayor de aproximadamente 200 mM.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medio de estabilización catódico se usa en la separación de analitos aniónicos mediante isotacoforesis de flujo libre (FF-ITP) y donde dicho medio de estabilización comprende un compuesto que tiene la movilidad electroforética efectiva más lenta hacia el ánodo (terminador) , y comprende además al menos una base fuerte;

y, opcionalmente, donde el terminador es un ácido tampón y el pKa del ácido tampón en dicho medio es preferentemente mayor que el pKa de la base tampón usada en el medio líder, más preferentemente donde la diferencia entre el pKa del ácido tampón del medio de estabilización catódico y el pKa de la base tampón del medio líder (∆pKa) está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3, más preferentemente entre aproximadamente 1, 5 y aproximadamente 2, 5; y/o la concentración del terminador es mayor que la concentración de la al menos una base fuerte; y/o la concentración del terminador está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 500 mM, y preferentemente entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 200 mM;

o donde dicho medio de estabilización catódico se usa en la separación de analitos catiónicos mediante isotacoforesis de flujo libre catiónica (FF-ITP) , donde dicho medio de estabilización catódico comprende al menos una base fuerte y al menos un ácido tampón, donde la concentración del ácido tampón es mayor que la concentración de la base fuerte; y, opcionalmente, donde la concentración de la al menos una base fuerte y del ácido tampón es mayor que la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP catiónica; y/o la concentración de la al menos una base fuerte y del ácido tampón es mayor que la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP catiónica y la concentración del ácido tampón y/o de la al menos una base fuerte está, independientemente entre sí, aumentada en un factor entre 1, 5 y 50 veces, preferentemente donde la concentración está aumentada entre 2 y 20 veces, y lo más preferentemente donde la concentración está aumentada entre 5 y 15 veces con respecto a la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP catiónica.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho medio de estabilización anódico para electroforesis se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

la concentración del al menos un ácido fuerte en el medio es suficiente para conseguir una protonación sustancial de todas las bases usadas en el medio de estabilización; donde preferentemente la relación de concentración entre la base o bases y el ácido o ácidos del medio de estabilización (relación de base o bases/ácido o ácidos) es al menos > 1, pero < 50, preferentemente donde la relación de concentración está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10; el pH del medio de estabilización anódico es menor que el pH del medio de separación; la base tampón se selecciona entre bases biológicamente aceptables y compuestos anfotéricos, con la condición de que el pKa de la función de ácido del compuesto anfotérico sea al menos 4 unidades mayor que el pKa de la función de base, preferentemente la base tampón se selecciona entre el grupo que consiste en taurina, glicina, ácido 2-aminobutírico, glicilglicina, β-alanina, GABA, EACA, creatinina, piridina-etanol, piridina-propanol, histidina, BISTRIS, morfolinoetanol, trietanolamina, TRIS, amediol, bencilamina, dietilaminoetanol, trialquilaminas; y el ácido fuerte se selecciona entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, y otros ácidos que tienen un pKa que es al menos 3 unidades de pK menor que el pKa de la base tampón de dicho medio.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho medio de estabilización anódico para electroforesis se caracteriza además por al menos uno de los siguientes:

el medio de estabilización anódico comprende además al menos un ácido tampón, con la condición de que la concentración de todas las bases en dicho medio sea mayor que la concentración de todos los ácidos; el pKa de cada base tampón en el medio de estabilización es igual o menor que el pKa de cada base tampón usada en el medio de separación; ∆pKa entre la base tampón del medio de estabilización y la base tampón del medio de separación es menor que 1, preferentemente menor que 0, 5; al menos una base tampón del medio de estabilización tiene una movilidad electroforética similar a la base tampón usada en el medio de separación; y al menos una base tampón del medio de estabilización es idéntica a la base tampón usada en el medio de separación.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde el pKa de cada una de las bases tampón del medio de estabilización anódico es menor que el pI del analito más ácido de la muestra que se va a separar; y, opcionalmente, donde dicho medio de estabilización anódico se define además por al menos uno de los siguientes:

el medio de estabilización anódico contiene más de una base tampón, preferentemente donde el medio de estabilización contiene al menos 2 o al menos 3 bases tampón; el pKa de cada una de las bases tampón del medio de estabilización anódico está dentro del intervalo (pI -3) <

pKa < (pI -0, 3) , preferentemente dentro del intervalo (pI -2) < pKa < (pI -0, 5) , y lo más preferentemente dentro del intervalo (pI -1, 3) < pKa < (pI -0, 5) ; el pH del medio de estabilización anódico es menor que el pH mínimo del medio de separación, preferentemente el pH del medio de estabilización anódico no es inferior de aproximadamente 2 unidades de pH por debajo del pH mínimo del medio de separación; y el valor de pKa de cada una de las bases tampón del medio de estabilización anódico es mayor que el valor de pH mínimo del medio de separación, preferentemente donde el valor de pKa de cada base tampón está en el intervalo de (pHmin -3) < pKa < (pHmin -0, 3) , más preferentemente dentro del intervalo (pHmin -2) < pKa < (pHmin 0, 5) , y lo más preferentemente dentro del intervalo (pHmin -1, 3) < pKa < (pHmin -0, 5) .

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde dicho medio de estabilización anódico se define además por al menos uno de los siguientes:

la concentración de las bases tampón del medio de estabilización anódico que tienen un menor pKa (bases más débiles) está aumentado con respecto a la concentración de la base tampón que tiene el menor pKa (base tampón más fuerte) , preferentemente, donde la concentración de las bases más débiles está aumentadaen un factor de al menos aproximadamente 2, y más preferentemente en un factor de al menos aproximadamente 3 con respecto a la concentración de la base tampón más fuerte de dicho medio; la concentración total de las bases tampón del medio de estabilización anódico es aproximadamente de 1, 1 a 50 veces, preferentemente aproximadamente de 2 a 20 veces, y lo más preferentemente aproximadamente de 5 a 15 veces mayor que la concentración de la base tampón del medio de separación; y la concentración total de todas las bases tampón del medio de estabilización anódico es mayor que aproximadamente 20 mM, preferentemente mayor que aproximadamente 50, y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 200 mM.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medio de estabilización anódico se usa en la separación de analitos catiónicos mediante isotacoforesis de flujo libre (FF-ITP) y donde dicho medio de estabilización comprende un compuesto que tiene la movilidad electroforética más lenta hacia el cátodo (terminador) , y comprende además al menos un ácido fuerte; y, opcionalmente, donde:

el terminador es una base tampón donde el pKa de la base tampón en dicho medio es preferentemente menor que el pKa del ácido tampón usado en el medio líder, donde más preferentemente la diferencia entre el pKa de la base tampón del medio de estabilización catódico y el pKa del ácido tampón del medio líder (∆pKa) está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3, más preferentemente entre aproximadamente 1, 5 y aproximadamente 2, 5; y/o la concentración del terminador es mayor que la concentración del al menos un ácido fuerte; y/o la concentración del terminador está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 500 mM, y preferentemente entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 200 mM;

o donde dicho medio de estabilización anódico se usa en la separación de analitos aniónicos mediante isotacoforesis de flujo libre aniónica (FF-ITP) , donde dicho medio de estabilización anódico comprende al menos un ácido fuerte y al

menos una base tampón, donde la concentración de la base tampón es mayor que la concentración del ácido fuerte;

y, opcionalmente, donde la concentración del al menos un ácido fuerte y de la base tampón es mayor que la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP aniónica, y/o la concentración del al menos un ácido fuerte y de la base tampón es mayor que la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP aniónica y donde la concentración de la base tampón y/o del al menos un ácido fuerte está, independientemente entre sí, aumentado en un factor entre 1, 5 y 50 veces, donde preferentemente la concentración está aumentada entre 2 y 20 veces, y más preferentemente donde la concentración está aumentada entre 5 y 15 veces con respecto a la concentración de los mismos compuestos en el medio líder de ITP aniónica.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el medio de estabilización anódico y/o catódico comprende además al menos un aditivo, preferentemente donde el al menos un aditivo se selecciona entre otros ácidos y/o bases, aniones y cationes mono y divalentes esenciales, potenciadores de la viscosidad, detergentes, agentes de solubilización de proteínas, ligandos de afinidad y agentes reductores, más preferentemente donde el al menos un aditivo se selecciona entre el grupo que consiste en tiourea, urea, derivados poliméricos hidrofílicos, tales como HPMC, PEGs, polialcoholes, tales como glicerol, hidratos de carbono tales como sacarosa, selectores quirales tales como dextrinas y ciclodextrinas, lectinas, mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) , iones calcio, iones magnesio, iones cinc, iones cloruro, iones sulfato, EDTA, EGTA, y azida.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde

la conductividad de dicho medio de estabilización es mayor de aproximadamente 500 μS/cm, preferente mayor de aproximadamente 1000 μS/cm, y lo más preferentemente mayor de aproximadamente 2000 μS/cm; y/o la conductividad del medio de estabilización es mayor en un factor de al menos aproximadamente 3, y preferentemente de al menos aproximadamente 5, y lo más preferentemente de al menos aproximadamente 10, que la conductividad del medio de separación.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la separación de poblaciones de liposomas en una muestra mediante electroforesis de flujo libre, donde el medio de separación tiene una conductividad menor de 1000 μS/cm, preferentemente donde el medio tiene una conductividad menor de 600 μS/cm.

16. El método de la reivindicación 15, donde al menos una fracción de los liposomas tiene una movilidad electroforética efectiva menor de aproximadamente 20 x 10-9 m2/Vs; y/o las concentraciones relativas del ácido tampón y de la base tampón en el medio de separación están entre 9:1 y 1:9, donde preferentemente la concentración del ácido tampón y de la base tampón en el medio de separación son prácticamente iguales; y/o el pH del medio de separación está entre 6 y 8, donde preferentemente el medio de separación tiene un pH de aproximadamente 7.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir 5 errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción