HIDROXI-FENIL PIRUVATO DIOXIGENASAS (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frenta a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen DIOXIGENASAS.

Una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD que tiene la secuencia de SEC ID No. 4.

Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas La presente invención se refiere a tecnología de ADN recombinante, y en particular a la producción de plantas transgénicas que muestran resistencia sustancial o tolerancia sustancial a herbicidas cuando se comparan con plantas similares no transgénicas. La invención también se refiere, entre otros, a las secuencias nucleotídicas (y sus productos de expresión) cuando se usan en la producción de, o cuando se producen mediante, dichas plantas transgénicas.

Las plantas que son sustancialmente “tolerantes” a un herbicida cuando se someten al mismo proporcionan una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la proporcionada por plantas semejantes no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen la “dosis” representada en el eje x, y el “porcentaje de exterminio”, “efecto herbicida”, etc., representado en el eje y. Las plantas tolerantes requerirán típicamente al menos el doble de herbicida que las plantas semejantes no tolerantes a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente “resistentes” al herbicida muestran pocas, si las hay, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo. Dentro del contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (HPPD) , 4hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (p-OHPP) son sinónimos.

Se conocen métodos para proporcionar plantas que son tolerantes a herbicidas HPPD, que comprenden la transformación del material vegetal con polinucleótidos que comprenden regiones que codifican enzimas de HPPD. Sin embargo, lo que hasta ahora no se ha reconocido generalmente es que diferentes enzimas de HPPD proporcionan diferentes niveles de tolerancia a diferentes herbicidas inhibidores de HPPD. Aunque una enzima de HPPD dada puede proporcionar un nivel útil de tolerancia a algunos herbicidas inhibidores de HPPD, puede ser bastante inadecuada para proporcionar niveles comerciales de tolerancia a un herbicida inhibidor de HPPD diferente más deseable, que, por ejemplo, puede controlar un espectro diferente de malas hierbas, puede ser más barato de obtener, o puede ofrecer beneficios medioambientales. Al igual que las enzimas de HPPD particulares y los polinucleótidos que las codifican, la actual invención también proporciona un medio para seleccionar enzimas de HPPD adecuadas para proporcionar niveles comercialmente útiles de resistencia a químicas de herbicidas inhibidores de HPPD particulares.

A fin de proporcionar plantas con tolerancia a tasas de aplicación comercialmente útiles de un herbicida de HPPD deseado, sería una ventaja usar polinucleótidos que codifican enzimas de HPPD que tienen susceptibilidad reducida a la inhibición por el herbicida de HPPD deseado o clase de herbicidas de HPPD. Esta característica de susceptibilidad reducida a la inhibición mediante herbicidas de HPPD in vitro se expresa también aquí como “resistencia incrementada” o “tolerancia inherente”.

Se reivindica que algunas formas mutantes de una HPPD de Pseudomonas sp. muestran tal resistencia incrementada en base a mostrar una tasa aparentemente disminuida de unión del inhibidor a la enzima (es decir, en base a medidas que corresponden esencialmente a kon en el equilibrio E + I +-EI, véase más arriba) . Sin embargo, tales formas enzimáticas mutantes tienen actividad catalítica reducida y/o estabilidad reducida, lo que potencialmente las hacen inadecuadas para uso, especialmente en los cultivos de climas templados, particularmente maíz y haba de soja, para los cuales los herbicidas inhibidores de HPPD proporcionan generalmente el espectro más útil de control de malas hierbas. No se ha conocido hasta ahora que diversas enzimas de HPPD de tipo salvaje sin mutar procedentes de diferentes fuentes pueden mostrar igualmente niveles inherentes útiles y diferentes de tolerancia, y que, además, las enzimas de tipo salvaje sin mutar son preferibles para uso en plantas transgénicas debido a que, en general, muestran una estabilidad y actividad (kcat/Km) considerablemente mejores que los derivados mutantes.

Hasta ahora no se ha apreciado además que el nivel de tolerancia inherente de estas enzimas de HPPD de tipo salvaje, o con mayor razón de enzimas de HPPD mutadas, puede variar notablemente según la clase particular y estructura de inhibidor de HPPD. Tampoco se ha conocido que estas diferencias en la tolerancia tienen su base no en diferencias en el parámetro kon, presentado por métodos de ensayo previamente usados, sino más bien en los parámetros Kd y koff. Tampoco se ha apreciado que estas diferencias en la tolerancia inherente pueden ser notables y útiles incluso entre enzimas de HPPD que tienen secuencias de aminoácidos relativamente similares como, por ejemplo, entre enzimas de HPPD de secuencias similares derivadas de diferentes especies de plantas. A fin de mantener el intervalo más amplio de opciones para modos de actuación de herbicidas útiles para el control de cultivos espontáneos, y para minimizar cualquier impacto potencial de flujo génico a malas hierbas, es deseable que la tolerancia a herbicidas conferida a plantas transgénicas se exprese preferentemente sólo frente a ciertas subclases deseadas de herbicidas inhibidores de HPPD. Esto es otro beneficio de ser capaces de escoger una enzima de HPPD particular muy adecuada para suministrar resistencia a un conjunto particular de tipos de herbicidas de HPPD. Cuando la palabra “específica” se usa conjuntamente con la resistencia de una proteína particular a un herbicida particular – o clase de herbicida -, el término no excluye obviamente cierto grado de sensibilidad – especialmente en el caso de que se apliquen niveles elevados (tasas de aplicación no comerciales) de herbicidas.

Por “herbicida tricetónico” se quiere decir un derivado de una ciclohexano-1, 3-diona o un biciclo[3, 2, 1]octano-2, 4diona.

Por “ácido sincárpico” se quiere decir un derivado de una 4, 4, 6, 6-tetrametilciclohexano-1, 3, 5-triona.

Los ejemplos de enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD son capaces de formar un complejo con un inhibidor de HPPD de Estructura I en el que la constante de disociación (Kd) de dicho complejo, en agua a pH 7, 0 y a 25ºC, está en el intervalo de 1, 0 a 30 nM, y/o la constante de velocidad de disociación del complejo, en agua a pH 7, 0 y a 25ºC, está en el intervalo de 4 x 10-5 a 2 x 10-3 s-1.

ESTRUCTURA L 2- (Nitro-4-metanosulfonilbenzoil) -ciclohexano-1, 3-diona El valor de kcat/Km de hidroxifenilpiruvato de estas enzimas de HPPD resistentes a inhibidores de HPPD está en el intervalo de 0, 8 a 5, 0 s-1 !M-1 a pH 7, 0 y 25ºC.

Otras enzimas de HPPD conocidas resistentes a inhibidores de HPPD, excluyendo aquellas derivadas de maíz, trigo y cebada, muestran, en comparación con una enzima de HPPD derivada de Arabidopsis, al menos una resistencia incrementada de 2, 5 veces a herbicidas seleccionados de aquellos de la Fórmula 1 y/o Fórmula 2 en comparación con herbicidas seleccionados de la Fórmula 3 y/o Fórmula 4 como se representan más abajo. Obsérvese que independientemente de qué estructuras se dibujen en una forma ceto, estas estructuras también pueden existir en una forma enólica, y que todas estas formas y todas las otras formas tautómeras también están incluidas en las fórmulas.

Fórmula 1

en las que los grupos A, B, D y E se escogen independientemente de fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. R1 o R2, o ambos, son H, o tanto R3 como R4 son H, y R5 o R6, o ambos, son H. R8 y R9

son ambos H, y R10 o R11, o ambos, son H. R12 o R13, o ambos, son H, y R14 o R15, o ambos, son H. Aparte de estas restricciones, R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR, y CO2H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi de C1-C4.

Sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR,... [Seguir leyendo]

1. Una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD que tiene la secuencia de SEC ID No. 4.

2. Plantas resistentes a inhibidores de HPPD que contienen un polinucleótido heterólogo que comprende una región que descodifica la enzima de la reivindicación 1.

3. Un método para proporcionar una planta que es tolerante a herbicidas que inhiben HPPD, que comprende la transformación del material vegetal con un polinucleótido que comprende una región que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores según la reivindicación 1, y la regeneración de ese material en una planta fértil morfológicamente normal.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido comprende además una región que codifica una 10 proteína capaz de dirigir la HPPD codificada por la secuencia hacia orgánulos subcelulares tales como el cloroplasto o mitocondria.

5. Una planta completa fértil morfológicamente normal obtenida mediante el método de la reivindicación 3 o reivindicación 4.

6. Un método para controlar selectivamente malas hierbas en un locus, que comprende plantas de cultivo y malas

hierbas, en el que las plantas se obtienen mediante el método de la reivindicación 3 o reivindicación 4, en el que el método comprende la aplicación al locus de una cantidad controladora de malas hierbas de un inhibidor de HPPD.

7. Un polinucleótido que comprende potenciadores transcripcionales y una región que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD según la reivindicación 1 bajo el control de expresión de su promotor autólogo.

Figura 1. Intercambio de 14C mesotriona de HPPD de trigo y de Arabidopsis Los círculos representan datos de HPPD de trigo, los triángulos datos obtenidos de HPPD de Arabidopsis 64 Figura 2. Intercambio de mesotriona y de la estructura II unida a HPPD de Arabidopsis con 14C mesotriona en exceso.

Figura 3. Inhibición progresiva de HPPD de trigo mediante la estructura II

Figura 4. Inhibición progresiva de HPPD de trigo mediante la estructura VI

Figura 5. Unión de 14C mesotriona a HPPD de Arabidopsis