Galactosilceramida modificada para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Composición, que comprende un compuesto representado por la fórmula estructural (II)**Fórmula**

un antígeno derivado de un tumor,

y un vehículo fisiológicamente aceptable, para su utilización en el tratamiento deenfermedades cancerosas, para estimular una respuesta inmunitaria antitumoral.

Galactosilceramida modificada para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Las células T asesinas naturales (“células NKT”) constituyen una población de células de memoria de tipo innato/células efectoras que expresan tanto receptores de células asesinas naturales (NK) como receptores conservados semi-invariantes de células T (TCR) , (Va14-Ja18/Vº£ en ratones y Va24-Ja18/Vº11 en el hombre) . Las células NKT se han visto implicadas en la supresión de la autoinmunidad y en el rechazo del injerto, en la mejora de la resistencia a los patógenos y en la mejora de la inmunidad tumoral.

Las células NKT reconocen antígenos lipídicos extraños y propios presentados por el elemento CD1d de la familia de las moléculas asociadas a las º2 microglobulinas. Diversos lípidos con distintas estructuras han demostrado poder unirse a moléculas CD1d de una única forma que encaja una cadena de ácidos grasos en cada uno de los dos lugares (A’ y F) de enlace hidrofóbico de la molécula CD1d. Las especies lipídicas capaces de unir moléculas CD1d incluyen ácidos micólicos, diacilgliceroles, esfingolípidos, poliisoprenoides, lipopéptidos, fosfomicoquétidos y pequeños compuestos hidrofóbicos. La conservación evolucionaria de las células NKT es sorprendente, pues las células NKT murinas reconocen la CD1d humana más el antígeno glicolípido y viceversa.

Las células NKT responden con una intensa producción de citoquinas a las horas de activación de TCR, liberando citoquinas de tipo TH1, incluyendo IFN-y y TNF, así como citoquinas de tipo TH2, incluyendo IL-4 e IL-13. Así, las células NKT muestran una función dual: actúan como células inmunosupresoras mediante su producción de citoquinas tipo TH2; y actúan también como promotores inmunes para potenciar la inmunidad mediada celular mediante la producción de citoquinas de tipo TH1.

Las células NKT se han estudiado, en primer lugar, en el contexto de la presentación de una a -galactosilceramida (aGC) , denominada KRN7000, un glicolípido que no se considera un antígeno natural para las células NKT. El aislamiento y cuantificación de las células NKT que responden a CD1d mediante citometría de flujo se ha llevado a cabo habitualmente utilizando tetrámeros CD1d marcados con fluorófonos, cargados con KRN7000, KRN7000 también se utiliza en estudios de las influencias de la estimulación de las células NKT en estados patológicos específicos. FUJI N. et al., CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 6, nº 8, 2000, páginas 3.380-3.387 da a conocer que se informó que KRN7000 estimula las células NKT humanas de una forma CD1d dependiente y que la inmunoterapia que utiliza KRN7000 se espera que sea una modalidad adyuvante útil en el tratamiento del cáncer residual postoperatorio en humanos. Sin embargo, el aprovisionamiento de KRN7000, que deriva de una esponja marina, se ha limitado, teniendo este glicolípido una solubilidad relativamente escasa en disolventes acuosos u orgánicos. LIU Y. et al., JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 312, nº 1-2, 30, 2006, páginas 34-39 da a conocer que PBS-57 tiñe las células NKT murinas y humanas, tanto como KRN7000 y muestra una solubilidad relativamente alta, y que PBS-57 estimula las células NKT de modo más efectivo que KRN7000.

Sumario de la invención Se encontró que las a-galactosilceramidas modificadas que se describen en la aplicación estimulaban las células NKT de modo más efectivo que KRN7000, tanto in vivo como in vitro. Además, estas moléculas pueden mostrar un aumento en la solubilidad y una potenciación de la carga en los tetrámeros CD1d.

En un aspecto, la aplicación describe un compuesto representado por la fórmula estructural (1) :

en la que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se definen a continuación en la presente invención. En otro aspecto, la aplicación describe un compuesto denominado “PBS-57”, representado por la fórmula estructural

(II) En otro aspecto, la aplicación describe un procedimiento para activar una células NKT, que incluye la puesta en contacto de la célula NKT con el compuesto de fórmula (1) en presencia de un monómero o tetrámero CD1d.

En otro aspecto, todavía, la aplicación describe un procedimiento para estimular una respuesta inmunitaria en un individuo. El procedimiento incluye una etapa de administración al individuo de una cantidad efectiva del compuesto de fórmula (1) . Alternativamente, el procedimiento de estimulación de una respuesta inmunitaria en un individuo comprende una etapa de administración al individuo de una polelación de células NKT activadas mediante la puesta en contacto de éstas con el compuesto de fórmula (1) en presencia de una molécula CD1. Como tercera alternativa, el procedimiento de estimulación de una respuesta inmunitaria en un individuo comprende la administración al

individuo de una población de células presentadoras del antígeno CD1 puestas en contacto con el compuesto de fórmula (1) .

En otro aspecto, todavía, la aplicación describe una composición que comprende un compuesto de fórmula (1) y un vehículo fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, la aplicación describe un procedimiento para marcar una célula NKT en un medio, que comprende las etapas de formar un complejo de fórmula (1) con un tetrámero CD1d, poniendo en contacto el complejo con la célula NKT, eliminando el complejo no unido del medio, y detectando el complejo.

La presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto representado por la fórmula estructural (II)

un antígeno derivado de un tumor, y un vehículo fisiológicamente aceptable, para utilizarla en el tratamiento de enfermedades cancerosas, para la estimulación de una respuesta inmunitaria anti-tumoral.

La presente invención también proporciona un compuesto representado por la fórmula estructural (II) : y un antígeno derivado de un tumor,

como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial, para uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Descripción breve de las figuras Las figuras 1A, 1B y 1C muestran un esquema sintético apropiado para PBS-57.

La Fig. 2 muestra las estructuras de un compuesto prototípico de la invención, denominado “PBS-57”, y KRN7000.

La Fig. 3 muestra la tinción de las polelaciones celulares Va14/NKT de un timo murino (A-C) y de células del bazo (D-F) con anti-TCRº-FITC y bien PBS-57 (C y F) , KRN7000 (B y E) o sólo el vehículo (A y D) .

La Fig. 4 muestra la unión de tetrámeros CD1d cargados con PBS-57 a progenies celulares de hibridomas NKT en el contexto de variantes VºTCR expresados por las células NKT. Los tetrámeros CD1d cargados con un glicolípido no estimulante (a-galactosicolesterol) , se utilizó como un control negativo.

La Fig. 5 muestra la tinción de células NKT que responden a CD1d utilizando tetrámeros CD1d humanos y murinos cargados con PBS-57 en muestras sanguíneas humanas y de primates no humanos.

La Fig. 6 muestra la liberación de citoquinas a partir de esplenocitos B6 murinos estimulados con PBS-57 (cuadros negros) o KNR7000 (cuadros blancos) .

La Fig. 7 muestra concentraciones séricas de INF-y y de ratones a los que se inyectó intravenosamente con cantidades indicadas de glicolípidos PBS-57 (líneas negras) o KRN7000 (líneas blancas) .

La Fig. 8 muestra estructuras para diversas formas de realización apropiadas de compuestos de la invención.

Descripción detallada de diversas formas de realización En un esfuerzo para encontrar compuestos que activen las células NKT, los inventores han sintetizado y estudiado una serie de a-galactosilceramidas modificadas (“aGCs”) . Como resultado de este trabajo, se determinó que una modificación apropiada en aGC des una adición de un doble enlace cis en la cadena acilo en la porción ceramídica del ácido graso. Se mostró que esta modificación aumentaba la solubilidad sobre los compuestos completamente saturados, facilitando la carga del glicolípido en el sitio de unión CD1d. Otra modificación apropiada reemplaza el grupo hidroxilo en la posición C6 de la galactosa en aGC con una amida unida a una pequeña molécula. Se encontró que estas modificaciones daban lugar a compuestos que conservan la capacidad de estimular la liberación histoquímica mediante las células NKT a niveles comparables a KRN7000.

Un compuesto prototípico de la invención, PBS-57 (que se muestra en la Fig. 1) , que incluye las modificaciones anteriormente descritas, tiñe las células NKT humanas y murinas como KRN7000 y exhibe una solubilidad relativamente alta. Estudios in vitro e in vivo de las propiedades estimulantes de las... [Seguir leyendo]

1. Composición, que comprende un compuesto representado por la fórmula estructural (II)

un antígeno derivado de un tumor, y un vehículo fisiológicamente aceptable, para su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, para estimular una respuesta inmunitaria antitumoral.

2. Composición para su utilización según la reivindicación 1, en la que la solubilidad del compuesto de fórmula (II) 5 es por lo menos de aproximadamente 20 mg/ml en DMSO.

3. Composición para su utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el compuesto de fórmula (II) puede unirse a un tetrámero o monómero CD1d.

4. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el compuesto de fórmula (II) puede activar una célula NKT.

5. Composición para su utilización según la reivindicación 1, en la que el compuesto de fórmula (II) se une mediante un tetrámero o monómero CD1d. 15

6. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la enfermedad cancerosa es un tumor sólido o hematológico.

7. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la enfermedad

cancerosa es seleccionada de entre el grupo constituido por leucemia, linfoma, cánceres relacionados con el SIDA, cánceres de huesos, cerebrales, de mama, del sistema gastrointestinal, del sistema endocrino, oculares, del tracto genitourinario, de células germinales, de órganos reproductores, de cabeza y cuello, del sistema musculoesquelético, de la piel, del sistema nervioso y del sistema respiratorio.

8. Compuesto representado por la fórmula estructural (II) :

y un antígeno derivado de un tumor,

como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial, destinada a su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas.

9. Preparación combinada para su utilización según la reivindicación 8, en la que la respuesta inmunitaria antitumoral es reforzada con respecto a la administración del antígeno derivado de un tumor solo.

10. Preparación combinada para su utilización según la reivindicación 8 ó 9, en la que la enfermedad cancerosa es un tumor sólido o hematológico.

11. Preparación combinada para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que la enfermedad cancerosa es seleccionada de entre el grupo constituido por leucemia, linfoma, cánceres relacionados con el SIDA, cánceres de huesos, cerebrales, de mama, del sistema gastrointestinal, del sistema endocrino, oculares, del tracto genitourinario, de células germinales, de órganos reproductores, de cabeza y cuello, del sistema musculoesquelético, de la piel, del sistema nervioso y del sistema respiratorio.