Electrodo enzimático.

Un electrodo enzimático que comprende una capa enzimática que contiene partículas de carbono quellevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleótido de flavina-adenina (FAD) como coenzima;

y una capa deelectrodo, en el que las partículas de carbono y la capa de electrodo están compuestas de partículas de carbono conun diámetro de partícula de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g.

Electrodo enzimático

Campo técnico

La presente invención se refiere a un electrodo enzimático sobre el que se sustenta una tinta que contiene glucosadeshidrogenasa, en particular, un electrodo enzimático usado como sensor de la glucosa, y un método para producir el electrodo enzimático.

Antecedentes de invención Un electrodo enzimático normalmente se refiere a un electrodo en el que se fija una enzima sobre la superficie de un electrodo tal como un electrodo de oro, un electrodo de platino, o un electrodo de carbono. Aprovechándose de la especificidad de la reacción de la enzima, el electrodo enzimático se ha usado ampliamente como un biosensor para detectar específicamente diversas sustancias fisiológicamente activas. En particular, el electrodo enzimático se puede usar como un sensor de la glucosa para medir la concentración de glucosa en sangre como un marcador importante en la diabetes. En el documento JP 2005 502045 se describen biosensores que comprenden un indicador redox, tal como un metal de transición, y una proteína que sufre un cambio en su conformación al unirse a un ligando.

Ejemplos de óxidorreductasas usadas para un electrodo enzimático incluyen deshidrogenasas representadas por la glucosa-deshidrogenasa (GDH) , y oxidasas representadas por la glucosa-oxidasa (GOD) . La GOD tiene una alta especificidad de sustrato respecto a la glucosa y una excelente estabilidad térmica. Ya que es posible la producción en masa de esta enzima, su coste de producción es inferior al de otras enzimas, lo cual resulta ventajoso. También, un sistema que usa GDH es poco probable que se vea influido por el oxígeno disuelto en una muestra para hacer medidas. Por lo tanto, incluso cuando la medida se lleva a cabo bajo condiciones de baja presión parcial de oxígeno o incluso cuando la medida se lleva a cabo con una alta concentración de muestra, lo que requiere una gran cantidad de enzima, la glucosa se puede medir de forma precisa.

En los casos donde estas óxidorreductasas se aplican al electrodo enzimático, ha habido el problema de que el valor de la corriente de respuesta del electrodo es bajo. Por lo tanto, con el fin de mejorar el valor de la corriente de respuesta del electrodo, los inventores de la presente invención propusieron un electrodo enzimático que tuviese una proteína de transferencia de electrones junto con un mediador de electrones (véase el documento de patente 2, más adelante) .

El mediador de electrones se refiere a una sustancia redox, tal como un complejo metálico no proteínico o un compuesto orgánico, siendo la sustancia capaz de mediar en la transferencia de electrones desde una óxidorreductasa a un electrodo. Ejemplos de ellos incluyen ferricianuro de potasio, metosulfato de fenazina, ferroceno y sus derivados.

Proteína de transferencia de electrones se refiere a una proteína capaz de ser reducida por los electrones que recibe procedentes de un donador de electrones y que luego se oxida donando los electrones a un aceptor de electrones en un sistema de oxidación-reducción en el cuerpo. Ejemplos de la transferencia de electrones incluyen el citocromo b y el citocromo c, y preferiblemente el citocromo b562 o similares.

En el documento de patente 1, una proteína de transferencia de electrones, junto con una óxidorreductasa, se inmoviliza sobre un electrodo, y por eso se puede promover la transferencia de electrones desde la óxidorreductasa al electrodo o a un mediador de electrones, obteniendo por ello un electrodo enzimático con un alto valor de la corriente de respuesta.

Para la medida de la concentración de glucosa usando estos electrodos enzimáticos, en general, se pone una solución reguladora en una celda con termostato, y se añade a ella una coenzima, CaCl2 y el mediador de electrones. Se mantiene luego la mezcla a temperatura constante. Después de eso, como electrodo de trabajo, por ejemplo, se usa un electrodo enzimático en el que se inmoviliza una enzima sobre un electrodo de carbono. Y se usan un contraelectrodo (por ejemplo, electrodo de platino) y un electrodo de referencia (por ejemplo, electrodo de Ag/AgCl) . Se aplica un voltaje constante al electrodo de carbono anteriormente mencionado y después de que la corriente eléctrica alcance un estado estacionario, se añade la muestra que contiene glucosa y luego se mide el aumento en la corriente eléctrica.

Por eso, estos métodos convencionales requieren el mediador de electrones que se va a incluir en el electrodo, que va a estar inmovilizado sobre la superficie del electrodo, o que se va a añadir a la celda con termostato como una solución acuosa. Y, se necesita proporcionar, por separado, el mediador de electrones y la óxidorreductasa. Por lo tanto, el procedimiento era complicado y hubo problemas con el coste de la producción en masa.

Documento de patente 1: JP 2003-121407 A

Documento de patente 2: WP 02/73181

Documento de patente 3: WO 2005/023111

El documento WO 2007/055100 describe un electrodo enzimático elaborado mezclando un polvo de carbono que tiene un nanonivel de partículas de platino sobre él, con una glucosa-deshidrogenasa cuya coenzima es el dinucleótido de flavina-adenina.

En el Analytical Chimica Acta, 192 (2) : 339-343, 1987, Pelleschi et al., se construyen sensores de glucosa inmovilizando glucosa-deshidrogenasa sobre electrodos de carbono y de platino.

Descripción de la invención Problemas que se van a resolver mediante la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un electrodo enzimático, que no requiere que se use un mediador de electrones y que no es inferior a los que usan el mediador de electrones, permitiendo que se obtenga un alto valor de la corriente de respuesta y que se obtenga un amplio intervalo dinámico, en particular cuando se usa como un sensor de la glucosa.

Medios para resolver los problemas En la presente invención, se ha descubierto que, cuando un electrodo enzimático compuesto de una capa enzimática que contiene partículas de carbono, sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa, y se usa una capa de electrodo que está en contacto con las partículas de carbono anteriormente mencionadas, como un sensor para medir glucosa, en el que el diámetro de las partículas de carbono anteriormente mencionadas y el de las partículas de carbono que componen la capa de electrodo anteriormente mencionada no es superior a 100 nm, y su superficie específica es de al menos 200 m2/g, los electrones se transfieren uniformemente entre la capa de electrodo anteriormente mencionada y las partículas de carbono que sustentan la glucosa-deshidrogenasa, o entre las partículas de carbono que componen la capa de electrodo y las partículas de carbono que sustentan la glucosadeshidrogenasa, y por eso se puede lograr la función como electrodo enzimático.

Por lo tanto, la presente invención permite que se aumente la corriente de respuesta en el electrodo enzimático anteriormente compuesto, ajustando el diámetro de partícula y la superficie específica de la partícula de carbono sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa, sin tener en cuenta la forma o el tamaño del material del electrodo que está en contacto con la partícula de carbono sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa.

También, la presente invención permite que se aumente más la corriente de respuesta en el electrodo enzimático anteriormente compuesto, usando las partículas de carbono como material del electrodo que está en contacto con las partículas de carbono sobre las que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa, así como ajustando su diámetro de partícula y la superficie específica.

La estructura concreta de la presente invención es como sigue:

(1) Un electrodo enzimático que comprende una capa enzimática que contiene partículas de carbono que llevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleótido de flavina-adenina (FAD) como una coenzima; y una capa de electrodo, en la que las partículas de carbono y la capa de electrodo están compuestas de partículas de carbono con un diámetro de partícula de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g.

(2) El electrodo enzimático según (1) , en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalítica de óxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.

(3) Un sensor de glucosa que comprende el electrodo enzimático según (1) o (2) , que se usa como un sensor de la glucosa.

(4) Un método para producir en electrodo enzimático según la reivindicación 4.

(5) El método según (4) , en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalítica de óxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalítica de óxidorreductasa... [Seguir leyendo]

1. Un electrodo enzimático que comprende una capa enzimática que contiene partículas de carbono que llevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleótido de flavina-adenina (FAD) como coenzima; y una capa de electrodo, en el que las partículas de carbono y la capa de electrodo están compuestas de partículas de carbono con un diámetro de partícula de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g.

2. El electrodo enzimático según la reivindicación 1, en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalítica de óxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalítica de óxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.

3. Un sensor de glucosa que comprende el electrodo enzimático según la reivindicación 1 ó 2.

4. Un método para producir un electrodo enzimático, que comprende revestir una superficie o una capa de electrodo con un material que constituye una tinta que comprende glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleótido de flavina-adenina (FAD) como coenzima; y partículas de carbono que tienen un diámetro de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g, en el que la capa de electrodo está compuesta de partículas de carbono con un diámetro de partícula de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g, y luego secar.

5. El método según la reivindicación 4, en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalítica de óxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalítica de óxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.

6. El método para producir un electrodo enzimático según la reivindicación 4 ó 5, que comprende además añadir un polielectrolito sólido a una película enzimática en la que se absorbe la enzima, o se aplica y se seca.

7. El método para producir un electrodo enzimático según la reivindicación 4 ó 5, en el que el material que constituye la tinta comprende además el polielectrolito sólido.

8. El método para producir un electrodo enzimático según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el 25 que dicho polielectrolito sólido es Nafion™.

9. Una celda enzimática de combustible que comprende el electrodo enzimático según la reivindicación 1 ó 2, en la que el electrodo enzimático se usa como ánodo.