Complejos colorantes de transferencia de energía controlados por la distancia.

Uso de al menos dos fluoróforos distintos entre sí para la formación de un par de transferencia de energía porresonancia de fluorescencia (par FRET),

en el que dentro del par FRET al menos un primer fluoróforo (A) sirve comofluoróforo donador y al menos un segundo fluoróforo (B) sirve como fluoróforo aceptor,

en el que el primer fluoróforo (A) y el segundo fluoróforo (B), independientemente entre sí, están configuradosrespectivamente a base de un complejo organometálico de elementos de las tierras raras, en el que los fluoróforos(A) y (B) presentan elementos distintos entre sí de las tierras raras, seleccionados del grupo de europio y terbio,en el que los elementos de las tierras raras en los fluoróforos (A) y (B) están complejados respectivamente con almenos un ligando en forma de un formador de complejos y/o quelatos, en el que el ligando es ácido picolínico,picolinatos y/o sus derivados y en el que el ligando presenta sustituyentes y/o grupos funcionales para la unión y/o elacoplamiento preferentemente covalente de moléculas preferentemente orgánicas, en el que los sustituyentes y/ogrupos funcionales se seleccionan del grupo de grupos amino, carboxilato, isocianato, tioisocianato, epoxi, tiol yhidroxilo, y

en el que el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) están acoplados y/o unidos entre sí a través de un resto orgánicobivalente y/o divalente.

Complejos colorantes de transferencia de energía controlados por la distancia La presente invención se refiere al uso de al menos dos fluoróforos distintos entre sí para la formación de un par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (par FRET) según el preámbulo de la reivindicación 1.

Además, la presente invención se refiere a un complejo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (complejo FRET) , que presenta al menos un primer fluoróforo (A) como fluoróforo donador y al menos un segundo fluoróforo (B) como fluoróforo aceptor así como un resto orgánico especial, que se une a los fluoróforos (A) y (B) .

Además, la presente invención se refiere al uso según la invención del complejo FRET según la invención para distintos fines, particularmente para la detección de un acontecimiento en una muestra o para la interacción con una molécula diana o una estructura diana y/o para la detección o identificación o para la verificación de una molécula diana o una estructura diana.

Además, la presente invención se refiere al uso del complejo FRET según la invención para otros fines de aplicación, por ejemplo como colorante, particularmente colorante de fluorescencia, o como respectivamente en biosensores o como respectivamente en (bio) sondas, particularmente sondas FRET.

Ciertos complejos organometálicos de las tierras raras, particularmente sus º-dicetonatos y sus carboxilatos aromáticos, han encontrado ya aplicaciones en distintos campos, en los que es ventajoso su mecanismo de luminiscencia único (denominado “efecto antena” o en inglés “antenna effect”) , por ejemplo en biosensores.

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) representa un procedimiento físico conocido en el estado de la técnica, en el que generalmente puede transmitirse energía de un colorante de fluorescencia excitado que se denomina de manera sinónima también donador o fluoróforo donador, a un segundo colorante de fluorescencia que se denomina de manera sinónima también aceptor

o fluoróforo aceptor o inhibidor. La intensidad de la transferencia de energía o de FRET depende, a este respecto, particularmente de la distancia de los dos fluoróforos uno con respecto a otro. El principio básico de FRET puede observarse en que entre dos colorantes que están capacitados para la fluorescencia puede transmitirse la energía de un fluoróforo donador excitado a un fluoróforo aceptor, no realizándose esta transmisión de energía en forma de fluorescencia, sino sin radiación, por ejemplo a través de interacciones dipolo/dipolo, al aceptor fluorescente.

Para facilitar una transmisión de energía sin radiación de este tipo al aceptor por medio des FRET, deben cumplirse diversos criterios. Por un lado, el espectro de emisión del donador debería solaparse con el espectro de absorción del aceptor. Por otro lado, el donador por una parte y el aceptor por otra parte deberían presentar niveles de vibración electrónicos paralelos, y finalmente el donador y el aceptor deberían estar distanciados entre sí sólo uno o algunos nanómetros, dado que la intensidad de la señal de FRET disminuye con la sexta potencia de la distancia de los dos fluoróforos uno con respecto a otro. Dado que la intensidad de FRET depende, entre otras cosas, de la separación de los dos fluoróforos, se ha establecido el uso de FRET en cierto modo como medida nanométrica óptica particularmente en bioquímica y biología celular, pudiéndose detectar en este contexto particularmente una prueba de interacciones de proteína/proteína, proteína/ácido nucleico y ácido nucleico/ácido nucleico así como modificaciones de la estructura espaciales, tales como modificaciones de la conformación de biomoléculas. En este contexto puede realizarse basándose en el fenómeno de FRET también una verificación de una interacción, homo y heterodimerización u oligomerización de proteínas. También es posible la medición de modificaciones de la conformación de proteínas cuando el fluoróforo donador y aceptor están acoplados a la misma molécula. Igualmente se usa el principio de FRET en biología molecular en la cuantificación de ácidos nucleicos con ayuda de PCR en tiempo real (Realtime-Polymerase Chain Reaction) mediante el uso de sondas especiales en la práctica.

En este contexto existe una posibilidad de uso de FRET para la cuantificación de ácidos nucleicos en el uso de las denominadas sondas LightCycler® que representan sondas de hidrólisis especiales, usándose como sondas para la cuantificación de productos de PCR distintos oligonucleótidos marcados respectivamente con un donador o aceptor que se unen uno al lado de otro a la secuencia diana de una molécula de ácido nucleico y con ello se llevan el donador y el aceptor a una proximidad suficiente para la FRET.

Otra posibilidad usada con frecuencia de FRET consisten en la aplicación de las denominadas sondas TaqMan® que representan sondas de hidrólisis especiales, estando marcada la sonda en un extremo con un aceptor o inhibidor y en su otro extremo con un colorante de fluorescencia donador o indicador. La fluorescencia del fluoróforo donador se suprime con sondas de hidrólisis intactas por el inhibidor mediante transferencia de energía sin radiación (FRET) . Durante un ciclo de PCR, la sonda hibrida con la cadena de ADN complementaria, permaneciendo suprimida inicialmente la fluorescencia del donador. La Taq-polimerasa suprime el extremo 5’ de la sonda durante los ciclos de PCR. La fluorescencia del donador ya no se extingue ahora por el inhibidor y puede medirse.

Otra posibilidad de la cuantificación en tiempo real de productos de PCR con el uso de FRET ofrece el uso de las denominadas balizas moleculares como sondas. Las balizas moleculares son oligonucleótidos que están acoplados tanto con un donador como con un inhibidor o aceptor. Los nucleótidos en el extremo 5’ de la sonda son complementarios a los nucleótidos en el extremo 3’, de modo que puede formarse una estructura secundaria a modo

de bucle característica para balizas moleculares. En este estado denominado Stem Loop (horquilla) , el donador no muestra ninguna fluorescencia mediante su baja distancia con respecto al aceptor. Mediante la adición de la región de bucle a una secuencia de ADN complementaria durante un ciclo de PCR se amplia la distancia entre el donador y el aceptor, de modo que puede observarse una fluorescencia de donador.

La estructura y el principio de funcionamiento de las balizas moleculares se describen detalladamente por Tyagi y Kramen (1996) : “Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization” en Nature Biotechnology 14, 303-308. Igualmente son el objeto de la patente estadounidense 5.925.517, que se toma como referencia completamente por el presente documento para fines de revelación con respecto a la estructura y funcionamiento de balizas moleculares.

Como par fluoróforo/inhibidor se conoce el ácido 5’- (2-aminoetil) -aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS) en el extremo 5’ y como inhibidor el ácido 4- (4’-dimetilamino) fenilazobenzoico (DABCYL) en el extremo 3’. Igualmente es adecuado también el uso de DABCYL en combinación con fluoresceína en el extremo 5’ (G. Leone, von Schijndel H., van Gemen B., Kramen R. F. y Schön D. (1998) “Molecular Beacon Probes Combined with Amplification by NASBA Enable Homogeneous Real-time Detection of RNA” en: Nucleic Acids Research 26, 9, 2150-2155) .

Dado que las balizas moleculares, debido a la extinción originada mediante FRET, en consecuencia no emiten o apenas emiten una radiación de fluorescencia u originan un desplazamiento espectral con el uso de dos fluoróforos y con ello alejan la señal de la zona de medición cuando la secuencia de muestra no se encuentra hibridada con la secuencia diana, han dado buen resultado las balizas moleculares en el pasado reciente especialmente como sondas en sistemas de verificación, en los que no es posible o no es deseable el lavado de sondas en exceso. Esto se aplica particularmente en la PCR en tiempo real o en la detección de ácidos nucleicos en células vivas (Liu X., Farmerie W., Schuster S., Tan W. (2000) : “Molecular beacons for DNA Biosensors with a Micrometer to Submicrometer Dimension” en: Analytical Biochemistr y 283, 56-63) .

Precisamente en sistemas biológicos complejos, tales como las células vivas, ha resultado sin embargo la fluorescencia inespecífica por ejemplo de componentes celulares como fuente de errores sistemática esencial que reduce claramente en general el valor informativo y la especificidad de los propios procedimientos... [Seguir leyendo]

1. Uso de al menos dos fluoróforos distintos entre sí para la formación de un par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (par FRET) , en el que dentro del par FRET al menos un primer fluoróforo (A) sirve como fluoróforo donador y al menos un segundo fluoróforo (B) sirve como fluoróforo aceptor, en el que el primer fluoróforo (A) y el segundo fluoróforo (B) , independientemente entre sí, están configurados respectivamente a base de un complejo organometálico de elementos de las tierras raras, en el que los fluoróforos (A) y (B) presentan elementos distintos entre sí de las tierras raras, seleccionados del grupo de europio y terbio, en el que los elementos de las tierras raras en los fluoróforos (A) y (B) están complejados respectivamente con al menos un ligando en forma de un formador de complejos y/o quelatos, en el que el ligando es ácido picolínico, picolinatos y/o sus derivados y en el que el ligando presenta sustituyentes y/o grupos funcionales para la unión y/o el acoplamiento preferentemente covalente de moléculas preferentemente orgánicas, en el que los sustituyentes y/o grupos funcionales se seleccionan del grupo de grupos amino, carboxilato, isocianato, tioisocianato, epoxi, tiol y hidroxilo, y en el que el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) están acoplados y/o unidos entre sí a través de un resto orgánico bivalente y/o divalente.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el fluoróforo (A) presenta terbio en forma de terbio (III) como metal de las tierras raras y/o porque el fluoróforo (B) presenta europio en forma de europio (III) como metal de las tierras raras.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los elementos de las tierras raras en los fluoróforos (A) y (B) están complejados a varios ligandos, preferentemente cuatro ligandos, y/o porque los elementos de las tierras raras en los fluoróforos (A) y (B) , independientemente entre sí, están unidos al al menos un ligando, particularmente a varios ligandos, preferentemente a cuatro ligandos, iónicamente, por coordinación y/o covalentemente, particularmente de manera covalente, y/o porque el ligando está configurado de manera multidentada, particularmente de manera bidentada y/o porque el ligando, particularmente formador de complejos y/o formador de quelatos, es ácido picolínico, picolinatos y/o sus derivados, particularmente derivados sustituidos, preferentemente hidroxiderivados, y/o porque el ligando es ácido hidroxipicolínico y/o hidroxipicolinato.

4. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fluoróforo (A) es un complejo organometálico según la fórmula

y/o porque el fluoróforo (A) se selecciona de tetra (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) terbio (III) , tris (piridin-2-carboxilato) (4hidroxipiridin-2-carboxilato) -terbio (III) , bis (piridin-2-carboxilato) -bis (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) terbio (III) , (piridin-2carboxilato) -tris (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) -terbio (III) y/o sus derivados y/o porque el fluoróforo (A) es un compuesto de fórmula general

[Tbx (Pic) y (Pic-Y) z] (4-3x) ,

en la que en la fórmula mencionada anteriormente

• Tb es terbio (III) ,

• Pic es picolinato,

• Y es un grupo funcional, particularmente seleccionado del grupo de grupos amino, carboxilato, isocianato, tioisocianato, epoxi, tiol y hidroxilo, preferentemente de un grupo hidroxilo,

• x es un número entero de 1 a 4, particularmente 1 ó 2, preferentemente 1 e

• y y z son respectivamente un número entero de 0 a 4 con y + z = 4.

5. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fluoróforo (B) es un complejo organometálico según la fórmula y/o porque el fluoróforo (B) se selecciona de tetra (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) europio (III) , tris (piridin-2-carboxilato) (4hidroxipiridin-2-carboxilato) europio (III) , Bis (piridin-2-carboxilato) -bis (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) europio (III) , (piridin-2-carboxilato) -tris (4-hidroxipiridin-2-carboxilato) europio (III) y/o sus derivados y/o porque el fluoróforo (B) es un compuesto de fórmula general

[Eux’ (Pic’) y’ (Pic’-Y’) z’] (4-3x’) -,

en la que en la fórmula mencionada anteriormente

• Eu es europio (III) ,

• Pic’ es picolinato,

• Y’ es un grupo funcional, particularmente seleccionado del grupo de grupos amino, carboxilato, isocianato, tioisocianato, epoxi, tiol y hidroxilo, preferentemente de un grupo hidroxilo,

• x’ es un número entero de 1 a 4, particularmente 1 ó 2, preferentemente 1 e

• y’ y z’ son respectivamente un número entero de 0 a 4 con y’ + z’ = 4.

6. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el resto orgánico bivalente y/o divalente es un ligador y/o espaciador y/o porque el resto orgánico se selecciona de manera que entre el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) puede producirse una transferencia de energía de fluorescencia, y/o porque el resto orgánico está acoplado y/o unido a los respectivos sustituyentes y/o a los respectivos grupos funcionales del ligando, particularmente como se define en las reivindicaciones anteriores y/o porque el resto orgánico está unido preferentemente de manera covalente con el fluoróforo (A) y/o el fluoróforo (B) , en el que particularmente el resto orgánico está unido y/o acoplado preferentemente de manera covalente a los grupos funcionales del o de los ligandos del fluoróforo (A) y/o (B) y/o en el que particularmente el resto orgánico presenta grupos funcionales aptos para la unión y/o el acoplamiento preferentemente covalente a los grupos funcionales del o de los ligandos.

7. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el resto orgánico es una secuencia de nucleótidos, particularmente una secuencia de ADN o ARN, preferentemente un oligonucleótido, o comprende ésta, en el que particularmente la secuencia de nucleótidos, particularmente en su extremo 5’ y extremo 3’, presenta secciones de secuencia de nucleótidos complementarias, particularmente de modo que con interacción no presente con una molécula diana y/o estructura diana resulta una hibridación de las secciones de secuencia de nucleótidos complementarias.

8. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) mediante la unión particularmente covalente a una secuencia de nucleótidos con secciones de secuencia de nucleótidos complementarias particularmente en su extremo 5’ y extremo 3’ forman una baliza molecular (BM) y/o

porque el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) con un resto orgánico forman una molécula de fórmula general según la figura 3, en la que en esta fórmula n representa un número entero en el intervalo de 1 a 20, particularmente de 2 a 15, preferentemente de 2 a 12.

9. Complejo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (complejo FRET) , que presenta al menos un primer fluoróforo (A) como fluoróforo donador y al menos un segundo fluoróforo (B) como fluoróforo aceptor, en el que el primer fluoróforo (A) y el segundo fluoróforo (B) , independientemente entre sí, están configurados respectivamente a base de un complejo organometálico de elementos de las tierras raras, en el que los fluoróforos (A) y (B) presentan elementos distintos entre sí de las tierras raras, seleccionados del grupo de europio y terbio, en el que los elementos de las tierras raras en los fluoróforos (A) y (B) están complejados respectivamente con al menos un ligando en forma de un formador de complejos y/o quelatos, en el que el ligando es ácido picolínico, picolinatos y/o sus derivados y en el que el ligando presenta sustituyentes y/o grupos funcionales para la unión y/o el acoplamiento preferentemente covalente de moléculas preferentemente orgánicas, en el que los sustituyentes y/o grupos funcionales se seleccionan del grupo de grupos amino, carboxilato, isocianato, tioisocianato, epoxi, tiol y hidroxilo, y en el que el fluoróforo (A) y el fluoróforo (B) están acoplados y/o unidos entre sí a través de un resto orgánico bivalente y/o divalente.

10. Uso de un complejo FRET según la reivindicación 9 para la detección de un acontecimiento en una muestra.

11. Uso de un complejo FRET según la reivindicación 9 para la interacción con una molécula diana y/o una estructura diana y/o para la detección y/o identificación y/o para la verificación de una molécula diana y/o una estructura diana, particularmente mediante la interacción del complejo FRET y/o del sistema FRET por un lado con la molécula diana y/o la estructura diana por otro lado.

12. Uso de un complejo FRET según la reivindicación 9 como colorante, particularmente colorante de fluorescencia, 20 particularmente para fines de marcación.

13. Uso de un complejo FRET según la reivindicación 9 en o como biosensores o sin embargo en o como sondas, particularmente sondas FRET.