Complejo de polímero anfifílo-PDGF.

Complejo de polímero anfifílo-PDGF, física y químicamente estable,

soluble en agua, caracterizado porque:

- los polímeros anfifílos están constituidos por un esqueleto polimérico hidrófilo funcionalizado por unossustituyentes hidrófobos y unos agrupamientos hidrófilos según la fórmula general siguiente,

* eligiéndose el polímero del grupo formado por dextranos y celulosas,

* siendo R, R' una unión o una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, eventualmente ramificaday/o insaturada, que comprende uno o varios heteroátomos, tales como O, N o/y S,

siendo R y R' idénticos o diferentes entre sí

* siendo F, F' un éster, un tioéster, una amida, un carbonato, un carbamato, un éter, un tioéter, unaamina,

siendo F y F' idénticos o diferentes entre sí

* siendo X un agrupamiento hidrófilo elegido del grupo constituido por:

• un carboxilato

• un sulfato

• un sulfonato

• un fosfato

• un fosfonato

* siendo Y un agrupamiento hidrófilo elegido del grupo constituido por:

• un sulfato

• un sulfonato

• un fosfato

• un fosfonato

* siendo Hy un agrupamiento hidrófobo elegido del grupo constituido por:

• un alquilo lineal o ramificado de C8 a C30,

eventualmente insaturado y/o que contiene uno o

varios heteroátomos, tales como O, N o S.

• un alquilarilo o un arilalquilo lineal o ramificado de

C8 a C18, eventualmente insaturado y/o que

contiene eventualmente un heteroátomo

• un policiclo de C8 a C30 eventualmente insaturado,

n y o están comprendidos entre 1 y 3,

h representa la fracción molar del motivo hidrófobo con respecto a una unidad de monómero, comprendidaentre 0,01 y 0,5

x representa la fracción molar de agrupamientos hidrófilos con respecto a una unidad de monómero,

comprendida entre 0 y 2,0.

y representa la fracción molar de agrupamientos hidrófilos con respecto a una unidad de monómero,comprendida entre 0 y 0,5,

- el PDGF se elige del grupo de los PDGFs (factores de crecimiento derivados de plaquetas).

Complejo de polímero anfifílo - pdgf

La presente invención concierne a nuevos complejos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) asociados a los polímeros anfifílos que permiten mejorar la estabilidad física y química in vitro e in vivo de la proteína terapéutica para aplicaciones farmacéuticasº

Los PDGF son glucoproteínas de aproximadamente 30.000 Daltons, formadas por dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí por dos puentes de disulfuro. Se han identificado cuatro tipos de cadenas, A, B, C y D. La proteína natural existe en forma de homodímero o de heterodímero de tipo AB (Oefner C. EMBO J. 11, 3921 - 2926, 1992) .

El PDGF se aisló por primera vez en las plaquetas. Estos son unos factores de crecimiento liberados durante la coagulación sanguínea, capaces de promover el crecimiento de diferentes tipos de células (Ross R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 1207; Kohler N. & Lipton A., Exp. Cell Res. 1974, 87, 297) . Ahora se sabe que el PDGF es producido por un cierto número de células distintas a las plaquetas y que es un mitógeno para la mayoría de las células derivadas del mesénquima, es decir, las células sanguíneas, musculares, óseas y cartilaginosas, así como las células del tejido conjuntivo (Raines E. W., en "Biology of Plalelet-Derivated Growth Factor", 1993, Westermark, B. y C. Sorg, Ed. Basel, Kerger, pág. 74) . Numerosos artículos tienden igualmente a demostrar que el PDGF procedente de los macrófagos se comporta como un agente quimiotáctico y mitógeno para las células musculares lisas, que contribuye al regruesamiento mioíntimo de las paredes arteriales característico de la arteriosclerosis (Ross R. y col., Science, 1990, 248, 1009) . Las actividades del PDGF incluyen además, y particularmente, la estimulación de la liberación de los gránulos por los monocitos neutrófilos (Tzeng D. Y. y col., Blood, 1985, 66, 179) , la facilitación de la síntesis de esteroides por las células de Leydig (Risbridger G. P., Mol. Cell, Endocrinol., 1993, 97, 125) , la estimulación de la fagocitosis neutrófila (Wilson E. y col., Proc, Nati. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 2213) , la modulación de la expresión y de la secreción de la trombospondina (Majak R. A. y col., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8821) y la post-regulación del gen ICAM1 en las células musculares lisas vasculares (Morisaki N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612) .

Teniendo en cuenta estas diversas propiedades, ya se ha contemplado la utilización de PDGFs recombinantes en el ámbito farmacéutico. Particularmente, la utilización del PDGF ha sido aprobada para el tratamiento de las úlceras del pie diabético (Regranex, J & J) y para la reparación periodontal (GEM 21S, Blomimetic) .

La cicatrización de las úlceras, así como la cicatrización cutánea general, es un fenómeno complejo el cual necesita la intervención coordinada en el tiempo y en el espacio de numerosos tipos celulares, que puede resumirse en tres fases: una fase de inflamación, una fase de proliferación y una fase de remodelado.

En la fase inflamatoria, de aproximadamente 7 días para una cicatrización normal, los macrófagos destruyen las bacterias, desbridan los tejidos dañados y regeneran los tejidos. Para hacer esto, los macrófagos segregan colagenasas, citocinas y factores de crecimiento.

En el transcurso de la fase de proliferación, desde el tercer día hasta la tercera semana para una cicatrización normal, se suceden tres acontecimientos. La herida se llena de tejido de granulación, se desarrolla la angiogénesis y la herida se cubre con células epiteliales. El tejido de granulación crece desde el borde hacia el centro. Los fibroblastos producen abundantemente colágeno de tipo III.

En el transcurso del remodelado, desde la tercera semana hasta uno o incluso dos años, los tejidos de granulación maduran, los fibroblastos producen menos colágeno. Los vasos sanguíneos formados en el transcurso de la granulación que son inútiles son eliminados mediante apoptosis. El colágeno de tipo III es sustituido por colágeno de tipo I que se organiza según las líneas de tensión y se reticula.

En este proceso, el PDGF juega un papel primordial. Durante la formación de una herida, las plaquetas se agregan y liberan el PDGF. El PDGF atrae a los neutrófilos, los macrófagos y los fibroblastos a la herida y es un potente mitógeno. Los macrófagos, las células endoteliales sintetizan y segregan a su alrededor PDGF. El PDGF estimula la producción de la nueva matriz extracelular por los fibroblastos, esencialmente los compuestos no colagénicos tales como los grupos glucosaminoglucanos y las proteínas de adhesión (J. F. Norton y col., Essential practice of surger y , Springer, 2003, capítulo 7, 77 - 89) .

Las heridas crónicas, tales como las úlceras del pie diabético, las úlceras venosas y las úlceras de presión, presentan la particularidad de cicatrizar muy lentamente y a menudo de forma incompleta, ya que el proceso de cicatrización no se desarrolla normalmente (R. Lobmann y col., J. of Diabetes and its complications, 2006, 20, 329 - 335) .

El proceso de cicatrización es, de hecho, un delicado equilibrio entre un proceso de destrucción necesario con el fin de eliminar los tejidos lesionados, y el proceso de reparación que conduce a la formación de nuevos tejidos. Las proteasas y los factores de crecimiento juegan un papel crucial en este proceso regulando este equilibrio. En el caso de las heridas crónicas, este equilibrio se rompe en favor de la degradación, lo que explica el retraso en la cicatrización. Dado que existen diferentes tipos de heridas crónicas, bioquímicamente son relativamente similares en el sentido de que se caracterizan por fases prolongadas de inflamación que conducen a unos niveles elevados de proteasas y

disminuyen así la actividad de los factores de crecimiento (G. Lauer y col., J, Invest. Dermatol. 115 (2000) 12 - 18) . Esta degradación de los factores de crecimiento contribuye a una pérdida global de los tejidos asociados a estas heridas crónicas, no favoreciendo la cicatrización (D. R. Yager y col., J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743 - 748) .

Actualmente existe en el mercado un medicamento basado en PDGF-BB recombinante humano correspondiente a la denominación común internacional "becaplermin", vendido bajo la denominación comercial Regranex®. Este medicamento está indicado para el tratamiento de las úlceras de los miembros inferiores de diabéticos. Se presenta en forma de un gel de aplicación tópica y permite promover la cicatrización de las úlceras. Permite, en particular, al igual que el PDGF endógeno, favorecer la proliferación celular, y por tanto, la formación de nuevos tejidos.

Este tratamiento tiene una eficacia limitada (Cullen y col., The international journal of biochemistr y & Cell Biology 34, 1544 - 1556, 2002) , incluso si los estudios clínicos han demostrado mejoras en la cicatrización y en la duración necesaria para la cicatrización (Greenhalgh y col., American Journal of pathology, 136, 1235 - 1246 1990; Ladin Plastic and Reconstructive Surger y , 105, 1230 - 1231 2000; Holloway y col., Wounds, 5/4, 198 - 206; Mandracchia y col., Clinics in Podiatric Medecine and Surger y , 18, 189 - 209, 2001; Wieman T. J., American Journal of Surger y , 176, 74S - 79S, 1998) .

El producto Regranex, que contiene PDGF-BS, comercializado por J&J, ha demostrado su eficacia aumentando el índice de curación hasta el 50% en los pacientes tratados frente a solamente el 36% para los pacientes que sólo han recibido un tratamiento estándar de la herida. A pesar de esta mejora significativa del tratamiento de la úlcera del pie diabético, es obligado constatar que solamente el 50% de los pacientes se curan tras un tratamiento prolongado y costoso. En el caso de que no haya curación, las consecuencias pueden ser extremadamente graves y conducir, en numerosos casos, a una amputación del miembro inferior. Es necesario añadir que la duración media del tratamiento es muy larga, de aproximadamente 20 semanas, y que su aplicación es costosa y exigente debido a la limpieza de la herida y a la aplicación de Regranex por la mañana seguido, 12 horas más tarde, de una limpieza de la herida. Estas dos intervenciones requieren muy a menudo el cuidado de una enfermera. Además, el coste medio de un tratamiento de una duración de veinte semanas es excesivamente elevado (del orden de 1.400 dólares americanos) .

La eficacia parcial puede explicarse por una degradación rápida del PDGF en la herida que se va a tratar. Esta degradación resulta, en el caso de una herida crónica, de un estado de inflamación prolongado que genera, a nivel de la herida, un entorno hostil para el PDGF... [Seguir leyendo]

1. Complejo de polímero anfifílo-PDGF, física y químicamente estable, soluble en agua, caracterizado porque:

-los polímeros anfifílos están constituidos por un esqueleto polimérico hidrófilo funcionalizado por unos sustituyentes hidrófobos y unos agrupamientos hidrófilos según la fórmula general siguiente,

• eligiéndose el polímero del grupo formado por dextranos y celulosas,

• siendo R, R' una unión o una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, eventualmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o varios heteroátomos, tales como O, N o/y S, siendo R y R' idénticos o diferentes entre sí 10 • siendo F, F' un éster, un tioéster, una amida, un carbonato, un carbamato, un éter, un tioéter, una amina, siendo F y F' idénticos o diferentes entre sí

• siendo X un agrupamiento hidrófilo elegido del grupo constituido por:

o un carboxilato 15 o un sulfato

o un sulfonato

o un fosfato

o un fosfonato

• siendo Y un agrupamiento hidrófilo elegido del grupo constituido por: 20 o un sulfato

o un sulfonato

o un fosfato

o un fosfonato

• siendo Hy un agrupamiento hidrófobo elegido del grupo constituido por:

o un alquilo lineal o ramificado de C8 a C30, eventualmente insaturado y/o que contiene uno o varios heteroátomos, tales como O, N o S.

o un alquilarilo o un arilalquilo lineal o ramificado de C8 a C18, eventualmente insaturado y/o que 30 contiene eventualmente un heteroátomo o un policiclo de C8 a C30 eventualmente insaturado, n y o están comprendidos entre 1 y 3, h representa la fracción molar del motivo hidrófobo con respecto a una unidad de monómero, comprendida

entre 0, 01 y 0, 5

x representa la fracción molar de agrupamientos hidrófilos con respecto a una unidad de monómero, comprendida entre 0 y 2, 0.

y representa la fracción molar de agrupamientos hidrófilos con respecto a una unidad de monómero, comprendida entre 0 y 0, 5,

- el PDGF se elige del grupo de los PDGFs (factores de crecimiento derivados de plaquetas) .

2. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el PDGF se elige del grupo formado por los PDGFs recombinantes humanos que comprenden dos cadenas B (rhPDGF-BB) .

3. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero se elige de entre los polímeros cuyos sustituyentes están repartidos de forma estadística.

4. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo hidrófobo Hy se elige del grupo formado por ácidos grasos, alcoholes grasos, aminas grasas, aminas bencílicas, derivados de colesterol y fenoles.

5. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo de las celulosas está constituido por celulosas funcionalizadas por ácidos, tales como carboximetil celulosa.

6. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo de dextranos está constituido por dextranos funcionalizados por ácidos, tales como carboximetil dextrano.

7. Complejo según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero es el carboximetil dextrano modificado por el éster metílico del triptófano.

8. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la formación del complejo de polímero anfifílo-PDGF es reversible.

9. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque satisface las pruebas de constatación de la estabilización química y física.

10. Complejo según la reivindicación 9, caracterizado porque las pruebas de constatación de la estabilización química y física se eligen del grupo constituido por la prueba de constatación del complejo (Gel Mobility Shift Assay) , la prueba de ralentización de la degradación enzimática poniéndolo en contacto con una proteasa y la prueba de estabilización física a pH fisiológico realizada mediante SDS-Page.

11. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proporción de PDGF/polímero anfifílo está comprendida entre 1/5 y 1/5.000.

12. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proporción de PDGF/polímero anfifílo está comprendida entre 1/100 y 1/5.000.

13. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proporción de PDGF/polímero anfifílo está comprendida entre 1/300 y 1/700.

14. Procedimiento de preparación del complejo de PDGF/polímero anfifílo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque este complejo de polímero/PDGF-BB se prepara en medio acuoso y en ausencia de un disolvente orgánico susceptible de desnaturalizar la proteína.

15. Composición terapéutica caracterizada porque ella comprende un complejo de polímero anfifílo-PDGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

16. Composición terapéutica según la reivindicación 15, caracterizada porque ella permite una administración de 100 !g por ml de PDGF.

17. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su utilización en el tratamiento de las úlceras por vía tópica.