Chip de matriz de micropocillos y su método de fabricación.

Un chip de matriz de micropocillos fabricado de silicio y que tiene múltiples micropocillos,

usándose cadamicropocillo para almacenar una única célula orgánica de muestra, en el que cada micropocillo es de un tamaño yforma que mantiene sólo una célula orgánica y en el que la superficie interior de dichos micropocillos está recubiertacon una película de fluorocarbono o una película de óxido de silicio.

Chip de matriz de micropocillos y su método de fabricación

Campo técnico El aspecto I de la presente invención se refiere a un chip de matriz de micropocillos que se puede usar para detectar células orgánicas tales como linfocitos específicos de antígeno. En particular, el aspecto I de la presente invención se refiere a un chip de matriz de micropocillos en el que se determina fácilmente la posición de un micropocillo dado.

El aspecto II de la presente invención se refiere a un chip de matriz de micropocillos, y un método para la fabricación del mismo, que tenga una buena eficacia de recogida de células orgánicas y una eficacia de recuperación de células orgánicas de los micropocillos.

El aspecto III de la presente invención se refiere a un chip de matriz de micropocillos fabricado de silicio que se puede usar para detectar células orgánicas tales como linfocitos específicos de antígeno. En particular, el aspecto III de la presente invención se refiere a un chip de matriz de micropocillos en el que las células orgánicas almacenadas en micropocillos se pueden recuperar fácilmente según se necesite.

Técnica anterior

De forma convencional, se han detectado linfocitos específicos de antígeno añadiendo aproximadamente 200.000 linfocitos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y cultivando los linfocitos en presencia de antígeno durante de tres días a una semana (Methods of Detecting linfocito Functions", Junichi YANO, Michio FUJIWARA, eds., Chugai Igakusha (1994) , "Methods of Conducting Immunity Experiments I, II", Shunsuke ISHIDA, Susumu KONDA, Morosuke MOTO, Toshiyuki HAMAOHKA, eds., Nankodo (1995) ) . Este método hace posible determinar que un linfocito específico de antígeno está presente dentro de un grupo de aproximadamente 200.000 linfocitos. Sin embargo, no permite la identificación de linfocitos específicos de antígeno individuales presentes dentro del grupo de linfocitos.

Por el contrario, en los últimos años se ha desarrollado y puesto en práctica un método en el que se mezclan moléculas de antígeno marcadas con pigmento fluorescente con linfocitos para provocar que el antígeno marcado de forma fluorescente se una a receptores de antígeno sobre los linfocitos específicos de antígeno, y los linfocitos que se han unido al antígeno marcado de forma fluorescente se detectan con un citómetro de flujo (Altman J.D.,

Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotype analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274: 94-96, 1996) . En este método, se puede identificar un linfocito individual que se ha unido a un antígeno. Además, también es posible separar un linfocito individual que se ha unido a un antígeno.

Sin embargo, el método de detección anterior requiere un dispositivo caro y complejo denominado clasificador de células para separación. Además, presenta los siguientes problemas:

(1) es difícil establecer las condiciones en el dispositivo para separación; se requiere una gran destreza para hacer

funcionar el dispositivo y para separar las células; 45

(2) debido al gran ruido de fondo, cuando la frecuencia del linfocito específico de antígeno es de un 0, 1 por ciento o menor, no se puede detectar el linfocito específico de antígeno;

(3) la eficacia de la separación de células es baja;

(4) se requiere tiempo para separar células a baja frecuencia; y

(5) aunque se puede confirmar la unión al antígeno, no se puede analizar la reacción por la que el linfocito se une al antígeno.

Se ha desarrollado otro método de detección de linfocitos específicos de antígeno en el que se mezclan moléculas de antígeno unidas a perlas magnéticas con linfocitos para provocar que el antígeno unido a la perla magnética se una a los receptores de antígeno de los linfocitos específicos de antígeno, y se usa un imán para separar los linfocitos específicos de antígeno (Abts H., Emmerich M., Miltenyi S., Radbruch A., Tesch H., CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of Immunological Methods 125:19-28, 1989) .

En este método, no se requiere un dispositivo complejo, las células se separan rápidamente, y se puede confirmar la unión del antígeno. Sin embargo, no se puede analizar cómo han reaccionado con el antígeno los linfocitos que se 65 han unido al antígeno (transmisión de señal intracelular, síntesis de ARN, síntesis de proteína, o alguna otra reacción fisiológica de la célula) . Además, no se pueden detectar linfocitos específicos de antígeno con una frecuencia de 0, 1 o menor.

Por el contrario, los presentes inventores realizaron varias investigaciones para proporcionar un método para detectar linfocitos específicos de antígeno que no requiere un dispositivo complejo, que separa las células rápidamente, que puede confirmar la unión de antígeno, que puede detectar linfocitos específicos de antígeno de baja frecuencia (0, 001 por ciento o más) , que permite el análisis de cómo reacciona con el antígeno el linfocito que se ha unido a un antígeno, y permite la separación de linfocitos específicos de antígeno. Los presentes inventores también desarrollaron un método de detección de la especificidad de antígeno de linfocitos individuales y de recuperación de los linfocitos específicos de antígeno que se detectan.

Sin embargo, no se conoce ningún chip de matriz de micropocillos que pueda detectar por separado la especificidad de antígeno de linfocitos individuales y permita la recuperación de los linfocitos específicos de antígeno que se detectaron.

En consecuencia, los presentes inventores realizaron una amplia investigación para proporcionar un chip de matriz de micropocillos que se pudo usar en el método de detección descrito anteriormente y que pudo mantener un linfocito individual en un micropocillo individual. Los presentes inventores fabricaron chips de matriz de micropocillos de prueba en los que los micropocillos de un aproximadamente un tamaño que pueda contener un único linfocito se formaron sobre una superficie de sustrato, y realizaron pruebas en las que los linfocitos se almacenaron (se recogieron) en micropocillos y se recuperaron de los micropocillos. En este proceso, los presentes inventores determinaron que cuando se recuperan linfocitos específicos de antígeno detectados en un chip de matriz en el que se han provisto múltiples micropocillos diminutos, y en particular, cuando se lleva a cabo la detección y recuperación en etapas separadas, la recuperación fiable de linfocitos específicos de antígeno sin error de los micropocillos en los que se habían detectado requirió una determinación fiable de las posiciones de los micropocillos. Esto es, en chips de matriz en los que están dispuestos de forma sencilla múltiples micropocillos, existe un problema porque es difícil determinar fácilmente la posición de un micropocillo específico.

En el proceso anterior, los presentes inventores determinaron además que cuando se lavó el chip de matriz después de recoger los linfocitos en los micropocillos usando una suspensión celular en el transcurso del almacenamiento de los linfocitos en los micropocillos, se produjo un problema porque un gran número de células terminaron fluyendo fuera de los micropocillos, lo que provocó que disminuyera notablemente la eficacia de la recogida y la tasa de llenado.

En consecuencia, el primer objetivo de la presente solicitud es proporcionar un chip de matriz de micropocillos que se preste a su uso en el método de detección descrito anteriormente y que permita el almacenamiento de linfocitos individuales en micropocillos individuales. En particular, el aspecto I de la presente solicitud tiene como objetivo proporcionar un chip de matriz de micropocillos que permita la fácil determinación de las posiciones de múltiples micropocillos diminutos.

El segundo objetivo de la presente solicitud es proporcionar un chip de matriz de micropocillos en el que las células tales como los linfocitos que se han recogido en los micropocillos no tiendan a fluir fuera de los micropocillos durante el lavado posterior.

El tercer objetivo de la presente solicitud es proporcionar un chip de matriz de micropocillos que se preste a su uso 45 en el método de detección descrito anteriormente y que pueda almacenar linfocitos individuales en micropocillos individuales.

En particular, el aspecto III, la presente invención, tiene como su objetivo proporcionar un chip de matriz de micropocillos que permite la fácil recuperación de un linfocito individual almacenado en... [Seguir leyendo]

1. Un chip de matriz de micropocillos fabricado de silicio y que tiene múltiples micropocillos, usándose cada micropocillo para almacenar una única célula orgánica de muestra, en el que cada micropocillo es de un tamaño y

forma que mantiene sólo una célula orgánica y en el que la superficie interior de dichos micropocillos está recubierta con una película de fluorocarbono o una película de óxido de silicio.

2. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos micropocillos es de forma cilíndrica, poliédrica compuesta de múltiples superficies, cónica inversa, piramidal inversa, o una 10 combinación de dos o más de las anteriores.

3. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el diámetro del círculo más grande que se puede inscribir dentro de la forma plana de los micropocillos entra dentro de un intervalo de 0, 5 a 2 veces el diámetro de la célula orgánica que va a estar contenida en los micropocillos, y la profundidad de los micropocillos entra dentro de un intervalo de 0, 5 a 4 veces el diámetro de las células orgánicas que van a estar contenidas en los micropocillos.

4. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula orgánica es un linfocito y el chip de matriz de micropocillos se usa para detectar linfocitos específicos de antígeno 20 individuales.

5. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, empleado de modo que se recupera del micropocillo una sola célula orgánica almacenada en un micropocillo individual.

6. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una región hidrófoba está proporcionada de manera que rodea dichos múltiples micropocillos sobre dicha superficie principal.

7. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha región hidrófoba tiene una 30 superficie de silicio o superficie que contiene flúor.

8. El chip de matriz de micropocillos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de micropocillos varía de aproximadamente 2.000 a 1.000.000 por cm2.