Cebadores de ácido nucleico y sondas para detectar VIH-1 y VIH-2.

Un conjunto de cebador/sonda para detectar los subtipos A-F del VIH-1 que consisten en el conjunto 2 decebador/sonda (SEC ID Nº 5. 6 y 7).

Cebadores de ácido nucleico y sondas para detectar VIH-1 y VIH-2

Campo de la invención La presente invención se refiere a oligonucleótidos y a procedimientos para detectar el VIH-1.

Antecedentes de la invención Los virus clasificados como VIH contienen ARN como información genética y la infectividad del VIH depende de la capacidad del virus para insertar su información genética en el ADN de un huésped. Con el fin de insertar su información genética y, por consiguiente, de infectar con éxito a un huésped, Un virus VIH debe convertir su material genético (ARN) en ADN de modo que la información genética del VIH sea compatible con la del huésped. Aparentemente, el VIH tiene éxito en la conversión de su ARN en ADN, dada la prevalencia del SIDA. No obstante, aunque el virus puede convertir con éxito el ARN en ADN, la conversión apenas es precisa. En otras palabras, la copia en ADN del ARN viral no siempre es exacta y la copia en ADN puede diferir del ARN viral en varios pares de bases. Por tanto, aunque inicialmente un huésped puede estar infectado con una única partícula de virus, tras varias rondas de replicación el huésped puede estar infectado con una población genéticamente diversa de virus.

Aunque el VIH no se ha clasificado de forma uniforme, generalmente está aceptado que el VIH-1 y el VIH-2 son virus diferentes. Dentro de cada una de estas clasificaciones de virus hay varios grupos o subtipos. Por ejemplo, dentro de la clasificación del VIH-1 existe el “grupo M”, que también se clasifica en los subtipos A-F, y el “grupo O”. Por otro lado, el VIH-2 contiene los subtipos A-E. Los subtipos del VIH-1 y el VIH-2 se dividen todavía más en categorías demasiado numerosas como para mencionarlas en este contexto. No obstante, cabe mencionar que estas divisiones se basan en la variación genética entre os virus y, de acuerdo con la teoría taxonómica, muchos de estos virus son la progenie de un único virus. Por consiguiente, los numerosos tipos y subtipos de VIH demuestran la naturaleza altamente mutable del VIH y la variabilidad genética del genoma del VIH.

La variabilidad genética de los virus se puede atribuir a la ineficiencia con la que el virus convierte su ARN en ADN, como se ha mencionado anteriormente. Otra teoría concerniente a la variabilidad genética de los virus es que los huéspedes pueden estar infectados con diferentes poblaciones de VIH (que, como se ha mencionado anteriormente, puede surgir por una infección producida por un único virus) y mediante el curso de la replicación y el empaquetamiento de la información genética viral, pedazos de un genoma viral se pueden recombinar con pedazos de otro genoma viral. Por consiguiente, tras el empaquetamiento del genoma recombinado se forma un virus genéticamente distinto. Con independencia del modo por el cual el virus muta, está claro que los virus conocidos como VIH tienen genomas altamente mutables y, por consiguiente, están en constante cambio. Esto hace que aquéllos que buscan procedimientos de detección de virus en función de su información genética se enfrenten con un objetivo en constante movimiento.

Aunque se sabe que determinadas regiones del genoma del VIH están conservadas, esto no significa que estas regiones son inmunes a mutaciones, en particular si las mutaciones en estas regiones no afectan a la estructura de una proteína codificada por estas regiones. Por consiguiente, el desarrollo de reactivos y procedimientos para detectar VIH en base a su información genética supone un reto continuo.

El documento EP 0727497 A divulga cebadores para la amplificación por PCR de una secuencia de ácido nucleico a partir del gen pol del VIH de tipo 1 humano y sondas para la detección del ácido nucleico amplificado usaron dichos cebadores.

En Respess, R.A. y col., "Detection of genetically diverse human immunodeficiency virus type 1 group M and O isolates by PCR", Journal of Clinical Microbiology, vol. 35, nº 5, 1997, páginas1284-1286, se describe la detección de aislados de grupos M y O del VIH-1 mediante en ensayo AMPLICOR HTV-1 de Roche y un sistema de cebadores/sondas.

El documento EP 0617132 A proporciona oligonucleótidos para amplificación y sondas de ensayo para hibridación para distinguir el VIH-1 humano de otros virus que se encuentran en tejidos sanguíneos humanos.

Gingeras T.R. y col., "Use of self-sustained sequence replication amplification reaction to analyze and detect mutations in zidovudine-resistant human immunodeficiency virus", The Journal of Infectious Diseases, vol. 164, nº 6, 1991, páginas 1066-1076 está dirigido a la determinación del genotipo del gen pol mutado del VIH-1 humano usando la replicación de secuencia autosostenida (3SR) e hibridación diferencial de tipo sándwich con esferas (BBSH) en aislados de VIH-1 resistentes a zidovudina.

El documento EP 0404625 se refiere a secuencias de oligonucleótidos derivados del genoma del virus VIH-2 ROD y del virus VIS-mac 142 y a su uso en un procedimiento in vitro para el diagnóstico de la infección de un individuo por un virus de tipo VIH-2.

En el documento WO 93/13223 se describen secuencias de sondas de ADN para la detección de un VIH en una muestra en un ensayo de hibridación de tipo sándwich en fase de solución. Además, se ilustran ensayos de hibridación de ácido nucleico amplificado usando las sondas.

El documento US 5629153 divulga una construcción de polidesoxinucleótido para usar junto con una ARN polimerasa dependiente de ADN, como amplificador de señal en ensayos de hibridación de ácido nucleico. También se divulga un procedimiento de uso de esta construcción en ensayos de hibridación. El procedimiento implica la formación de un complejo de hibridación que comprende la construcción y la secuencia diana, la adición de una polimerasa específica del promotor en la construcción y la cuantificación del transcrito de ARN resultante.

En el documento FR 2652091 se divulgan secuencias de nucleótidos derivadas de los genomas de virus de los tipos VIH-1 o VIH-2 o virus del tipo VIS, así como su aplicación como cebadores olgonucleotídicos para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo con un virus de los tipos VIH-1 y/o VIH-2.

Carman, W.F. y col., "Detection of enzymatically amplified human immunodeficiency virus DNA by oligonucleotide solution hybridization and by incorporation of radiolabeled deoxynucleotides", Journal of Clinical Microbiology, vol. 27, nº 11, Noviembre de 1989, páginas 2570-2573 describen dos procedimientos para detectar in vitro ADN del virus VIH amplificado enzimáticamente con sensibilidad mejorada con respecto a la tinción con bromuro de etidio. El primer procedimiento hace referencia a una hibridación en solución de oligonucleótidos marcados con productos amplificados. El segundo procedimiento implica la incorporación de desoxinucleótidos radiomarcados en la cadena de ADN en elongación.

Los documentos WO 94/03635 and US 5569582 divulgan procedimientos, cebadores, sondas y kits para la rápida amplificación y detección de ácidos nucleicos, en particular del genoma del VIH-1. También se proporciona un procedimiento mejorado para amplificar cantidades pequeñas de ácido nucleico en una muestra en la que las etapas de amplificación se realizan a la misma temperatura o, como alternativa, a dos temperaturas diferentes. También se proporcionan procedimientos para detectar el ácido nucleico amplificado en los que la señal de detección se refuerza, así como sondas y kits de ensayo relacionados.

En Brown V. y col., "Detection of HIV-1 and -2 infection by the polymerase chain reaction (PCR) ", Resumen de la reunión general de la Sociedad Americana de Microbiología, vol. 91, nº 0, 1991, página 335, se divulga la necesidad del uso de múltiples pares de cebadores para maximizar la detección de infección por VIH-1 y por VIH-2, ya que la mayoría de los pares de cebadores específicos del VIH-2 analizados en este estudio eran capaces de detectar muchas, aunque no todas, muestras de pacientes seropositivos para el VIH-2.

El documento WO 97/07235 divulga un procedimiento para detectar una secuencia de ácido nucleico diana usando amplificación de ácido nucleico, donde las sondas de hibridación para la detección de la secuencia diana amplificada están presentes durante la reacción de amplificación.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un conjunto de cebador/sonda para detectar los subtipos A-F del VIH-1 que consisten en el conjunto 1 de cebador/sonda (SEC ID Nº 5, 6 y 7) .

La presente invención proporciona además un procedimiento de detección de los subtipos A-F del VIH-1 en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de (a)... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de cebador/sonda para detectar los subtipos A-F del VIH-1 que consisten en el conjunto 2 de cebador/sonda (SEC ID Nº 5. 6 y 7) .

2. Un método para detectar los subtipos A-F del VIH-1 en una muestra de ensayo, comprendiendo las etapas de:

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de ácido nucleico, el conjunto de cebador/sonda de la reivindicación 1 y una muestra de ensayo que contiene una secuencia diana del VIH;

(b) someter la mezcla a las condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana;

(c) hibridar la sonda con la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que comprende la sonda y la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana; y

(d) detectar el híbrido como indicación de la presencia del VIH en la muestra de ensayo.

3. El método de la reivindicación 2, donde dichos reactivos de amplificación incluyen una enzima que tiene actividad de transcriptasa inversa y dicho procedimiento comprende además la etapa, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b) , de formar un ADNc a partir de un genoma del VIH.

4. El método de la reivindicación 2, donde la etapa (b) se repite entre 10 y 100 veces.

5. Un kit para detectar los subtipos A-F del VIH-1, que comprende:

6. El kit de la reivindicación 5, donde dichos reactivos de amplificación comprenden una enzima que tiene actividad de transcriptasa inversa.

a) el conjunto 2 de cebador/sonda (SEC ID Nº 5, 6 y 7) , y b) reactivos de amplificación.