Agente de tinción de microorganismos y su uso.

Un agente de tinción de microorganismos que comprende una sustancia alcalina en una cantidad de 15-30% enmasa y un colorante seleccionado entre Chicago Sky Blue 6B t Rodamina B.

Agente de tinción de microorganismos y su uso

Campo técnico La presente invención se refiere a un agente de tinción de microorganismos, y, de forma más específica, a un agente de tinción de microorganismos capaz de teñir microorganismos tales como bacterias y hongos más rápidamente que los métodos convencionales y a un método de detección de microorganismos que utiliza el agente de tinción de microorganismos.

Antecedente de la técnica Los métodos convencionales para detectar microorganismos tales como bacterias y hongos incluyen un método de recuento microscópico directo donde se examina microscópicamente un espécimen tras pretatarse y un método de examen del cultivo donde el espécimen se examina tras cultivar los microorganismos. El método de recuento microscópico directo se utiliza a menudo en los centros médicos debido a la comodidad.

Como métodos conocidos para el pretratamiento en el método de recuento microscópico directo, se pueden indicar

un método de hidróxido de potasio, un método de dimetilsulfóxido (DMSO) -hidróxido de potasio, y el método de tinta Parker -hidróxido de potasio (Hideyo Yamaguchi y col., Report of the Standardization Committee of the Japanese Society for Medical Mycology, "Jpn. J. Med. Mycol.", 1995, Vol. 6, pp. 61-86)

Como los métodos de hidróxido de potasio y DMSO-hidróxido de potasio no tiñen el microorganismo, existen problemas tales como la dificultad de detectar Malassezia y los requisitos de habilidad en la detección con microscopio. Aunque el microorganismo se tiña con el método de tinta Parker-hidróxido de potasio, el método tiene el problema de requerir un lapso de tiempo largo para la tinción, desde algunas horas a toda la noche. Existen también problemas debidos a que el tipo de tinta que se puede usar en este método de tinción está restringido. Puesto que la propia tinta por sí está comprendida por varios componentes, la capacidad de tinción de las bacterias puede cambiar de acuerdo con la composición de la tinta.

Por tanto, para superar los problemas durante el pretratamiento en el método convencional de recuento microscópico directo, un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente de tinción que puede teñir microorganismos rápidamente y un método de tinción y detección de microorganismos que utiliza el mismo.

Divulgación de la invención A la vista de estas circunstancias, los inventores han llevado a cabo una extensa investigación para conseguir el objetivo anterior y han descubierto que la tinción y detección de microorganismos se puede llevar a cabo rápidamente utilizando un agente de tinción que comprende un 15-30% de una sustancia alcalina y un colorante específico seleccionado entre Chicago Sky Blue 6B o Rodamina B, completando de esta forma la presente invención.

La presente invención proporciona también un método de detección de microorganismos caracterizado por la tinción 45 de microorganismos añadiendo el agente de tinción a un espécimen que comprende microorganismos y detectando los microorganismos teñidos.

Breve descripción de los dibujos 50 La Fig. 1 muestra una fotomicrografía (x400) de la tinción llevada a cabo utilizando el agente de tinción del Ejemplo 1. La Fig. 2 muestra una fotomicrografía (x400) de la tinción llevada a cabo utilizando el agente de tinción del Ejemplo 7.

Mejor modo de llevar a cabo la invención El agente de tinción de microorganismos de la presente invención (denominado a partir de ahora en el presente documento como “agente de tinción de la presente invención”) comprende un 15-30% de una sustancia alcalina y un colorante, seleccionado entre Chicago Sky Blue 6B o Rodamina 6B.

Como ejemplos de la sustancia alcalina utilizada en el agente de tinción de la presente invención, se pueden indicar álcalis inorgánicos tales como hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de bario, y similares. De estas sustancias alcalinas, son preferibles hidróxido de sodio e hidróxido de potasio, siendo particularmente preferible hidróxido de potasio.

Chicago Sky Blue 6B se incorpora en el agente de tinción de la presente invención en una cantidad de 0, 01-2% y preferentemente 0, 1-1%.

Rodamina B se incorpora en el agente de tinción de la presente invención en una cantidad de 0, 001-1% y 5 preferentemente 0, 005-0, 5%.

Además de los componentes anteriores, el agente de tinción de la presente invención puede comprender metanol y/o dimetilsulfóxido. El metanol se incorpora preferentemente en el agente de tinción de la presente invención en una cantidad de 0-30%, siendo particularmente preferible 0-20%. El dimetilsulfóxido se incorpora preferentemente en el

agente de tinción de la presente invención en una cantidad de 0-20%, siendo particularmente preferible 0-10%.

Debido a que la adición del metanol y/o el dimetil sulfóxido puede controlar la capacidad de tinción de la célula sin afectar la capacidad de tinción del microorganismo, el agente de tinción que comprende el metanol y/o el dimetil sulfóxido tiñe de forma distintiva el microorganismo permitiendo de este modo una fácil detección del mismo.

Además, el metanol y/o el dimetilsulfóxido son particularmente eficaces cuando se usan con los colorantes de tipo diazo y xanteno que tienen una baja solubilidad en una disolución alcalina tal como Rodamina B debido a que el metanol y/o el dimetilsulfóxido pueden aumentar la solubilidad de estos colorantes.

En la fabricación del agente de tinción de la presente invención, la sustancia alcalina se disuelve en agua para obtener una disolución alcalina y se añaden a la disolución el diazocolorante o el xantenocolorante y, cuando es necesario, el metanol y/o el dimetilsulfóxido, y se mezclan. El colorante que tiene una baja solubilidad en una disolución alcalina se disuelve en uno o más tipos de metanol o dimetilsulfóxido antes de la manipulación y se mezclan con la disolución alcalina.

El agente de tinción de la presente invención obtenido de esta manera se puede usar para la tinción de los hongos cutáneos tales como Trichophyton, hongos tales como Candida, Malassezia, y similares, y bacterias tales como las bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas, y similares.

Se describirá ahora el método para detectar microorganismos que utilizan el agente de tinción de la presente 30 invención.

Para detectar microorganismos que utilizan el agente de tinción de la presente invención, los microorganismos se tiñen aplicando el agente de tinción de la presente invención a una muestra tomada de una zona donde se piensa que los microorganismos están presentes y la muestra se deja reposar durante aproximadamente 20-30 minutos. Se 35 pueden utilizar diversos tipos de muestras de acuerdo con la zona de extracción. Por ejemplo, cuando se va a detectar Trichophyton en el pie o el cabello, se toman muestras de queratina de la caspa, vesículas, revestimiento de vesículas, pápulas, y similares, cuando se va a detectar Trichophyton en las uñas, se toman muestras del sustrato de la placa de la uña, y similares, y cuando se va detectar mentagra o kerion, se utiliza como muestra el cabello enfermo que se puede retirar fácilmente de una lesión. El agente de tinción de la presente invención se aplica usualmente a la muestra en una cantidad de aproximadamente algunas gotas.

Puesto que el agente de tinción de la presente invención tiene una elevada estabilidad térmica, el espécimen se puede calentar a 60-80º C durante aproximadamente 2-5 minutos utilizando una placa caliente a temperatura fija o similar después de aplicar el agente de tinción de la presente invención al espécimen con el fin de teñir el

microrganismo en un corto periodo de tiempo.

El espécimen al cual se aplica el agente de tinción de la presente invención se coloca, por ejemplo, sobre un porta de vidrio, y se cubre con un cubre de vidrio, y la parte superior del cubre de vidrio se presiona ligeramente con una varilla de vidrio o similar a fin de diseminar la muestra en capas finas. A continuación se observa la presencia de 50 tinción en la muestra utilizando un microscopio o similar con un aumento de 100-200x.

Tras confirmar la presencia de la tinción, la muestra se examina adicionalmente utilizando un microscopio con un aumento de 400x para detectar la presencia de hongos cutáneos tales como Candida, Malassezia, y similares en la muestra observando la forma parasítica de estos microorganismos. Se puede determinar la presencia de bacterias 55 tales como bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas observando la muestra a un aumento de 1000x.

Mediante el uso del agente de tinción... [Seguir leyendo]

1. Un agente de tinción de microorganismos que comprende una sustancia alcalina en una cantidad de 15-30% en masa y un colorante seleccionado entre Chicago Sky Blue 6B t Rodamina B 5

2. El agente de tinción de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además metanol y/o dimetilsulfóxido.

3. El agente de tinción de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el microorganismo que se 10 va a teñir es un hongo.

4. El agente de tinción de microorganismos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el microorganismo que se va a teñir es una bacteria.

5. Un método para detectar microorganismo que comprende aplicar el agente de tinción de microorganismos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a una muestra que comprende microorganismos para teñir los microorganismos, seguido por la detección de los microorganismos teñidos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, donde la muestra se calienta .

6. 80º C durante 2-5 minutos tras 20 añadir el agente de tinción de microorganismos a la muestra.