SISTEMA DE MEJORA DE SEÑAL CON RESTOS MARCADOS MÚLTIPLES.

Sistema de mejora de señal con restos marcados múltiples Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para someter a ensayo la presencia de un analito en una disolución de ensayo y a estuches para llevar a cabo dichos métodos. Un método convencional para someter a ensayo la presencia de un analito en una disolución de ensayo comprende capturar el analito sobre una varilla y detectar la presencia del analito sobre la varilla. La varilla presenta un extremo de contacto para poner en contacto la disolución de ensayo y una zona de captura lejos del extremo de contacto en la cual se inmoviliza el anticuerpo anti-analito (el anticuerpo de captura). Para someter a ensayo la presencia del analito, el extremo de contacto de la varilla se pone en contacto con la disolución de ensayo. Si el analito se encuentra presente en la disolución de ensayo viaja hasta la zona de captura de la varilla por medio de la acción capilar donde es capturado por el anticuerpo de captura. La presencial del analito en la zona de captura de la varilla se detecta por medio de otro anticuerpo anti-analito (el anticuerpo de detección) marcado con, por ejemplo, oro coloidal. Estos ensayos de varilla presentan varias ventajas. Son fáciles y baratos de llevar a cabo, no requieren instrumentos especializados y los resultados se obtienen de forma rápida y se puede leer visualmente. Por tanto, estos ensayos resultan particularmente apropiados para su uso en consultorio médico, domicilio, zonas lejanas y países en desarrollo donde el equipamiento especializado puede no estar disponible. Se pueden usar, por ejemplo, para someter a ensayo si el paciente se encuentra infectado con una enfermedad provocada por microorganismos tales como Chlamydia trachomatis. No obstante, la sensibilidad de detección del analito que se usa en dichos ensayos es relativamente baja. Por consiguiente, si el analito únicamente está presente en pequeñas cantidades en la disolución de ensayo puede permanecer no detectado. Esto constituye una desventaja particular si el ensayo se usa para diagnosticar si el paciente presenta o no una enfermedad particular ya que puede ocurrir que la enfermedad no sea diagnosticada en el paciente. Este es particularmente el caso en el que el paciente es asintomático, pero también en el que los síntomas están presentes pero es necesario confirmar que éstos son producidos por la enfermedad particular, o cepa de enfermedad particular. El documento WO 00/25135 describe un sistema de detección de varilla de dos etapas para la detección de antígenos. El sistema de detección usa un anticuerpo de biotina anti-antígeno y un anti-cuerpo anti-biotina marcado con oro coloidal (conjugado de oro anti-biotina). En la primera etapa, el anticuerpo de biotina se mezcla con la disolución de ensayo y la punta de la membrana de la varilla se sumerge posteriormente en la mezcla de forma que la mezcla acuosa impregne la membrana por medio de la acción capilar. El antígeno de la mezcla unido al anticuerpo con marcador de biotina es capturado por un anticuerpo anti-antígeno inmovilizado en la zona de captura de la varilla para formar un complejo que comprende el anticuerpo anti-antígeno inmovilizado, el antígeno y el anticuerpo con marcador de biotina. En la segunda etapa, la varilla se sumerge en una suspensión por separado del conjugado de oro de anti-biotina. El conjugado de oro anti-biotina impregna la membrana por medio de la acción capilar y se une al anticuerpo de biotina capturado con el antígeno en la zona de captura. Posteriormente, el antígeno es detectado por medio de la presencia de un marcador de oro en la zona de captura. Mientras que el sistema de dos etapas puede proporcionar una mayor sensibilidad, resulta deseable mejorar la sensibilidad de detección del analito. La solicitud de patente europea Nº. 0354847 describe un marcador de fluorescencia con agentes de formación de quelato de europio, que evita el conocido efecto de interrupción debido al marcador múltiple. La patente de EE.UU. Nº. 4.228.237 describe un método para la detección de un ligando que utiliza una enzima marcada con avidina y un reactivo marcado con biotina. De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un método para someter a ensayo la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una banda cromatográfica que tiene un extremo de contacto para poner en contacto la disolución de ensayo y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la banda cromatográfica lejos del extremo de contacto, comprendiendo el resto de captura un miembro de un par de enlace ligando/anti-ligando capaz de unirse, por medio de una interacción de emparejamiento distinta de base de ácido nucleico, al analito o a uno de sus derivados, como el otro miembro del par de enlace ligando/anti- 2   ligando; b) poner en contacto un agente de dirección, capaz de unirse al analito o a su derivado, con la disolución de ensayo para permitir la unión del agente de dirección al analito o a su derivado en la disolución de ensayo, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos; c) unir un marcador a cada uno de los dos o más ligandos del agente de dirección, d) poner en contacto el extremo de contacto de la banda cromatográfica con la disolución de ensayo para permitir que el analito, o uno de sus derivados, unido al agente de dirección marcado se desplace hasta la zona de captura por medio de la acción capilar y sea capturado por el resto de captura; y e) detectar la presencia del marcador en la zona de captura. De acuerdo con la invención, el agente de dirección es unido a los marcadores para formar el agente de dirección marcado antes de que entre en contacto con la zona de captura. Estos contrastan con el método del documento WO 00/25135 en el que el anticuerpo de biotina y el conjugado de oro anti-biotina se impregnan hasta la membrana de la varilla en dos etapas por separado. De manera sorprendente, se ha encontrado que la sensibilidad de los métodos que usan la detección de analito es mayor que la del método de dos etapas del documento WO 00/25135. En condiciones óptimas, la sensibilidad de la detección de analito es al menos un orden de magnitud mayor que la sensibilidad de detección que usa el método de dos etapas. Para llevar a cabo el método del primer aspecto de la invención, se puede añadir simplemente el agente de dirección y los marcadores a la disolución de ensayo y posteriormente se pone en contacto la disolución de ensayo con el extremo de contacto de la banda cromatográfica. Dichos métodos son más fáciles de llevar a cabo que el método descrito en el documento WO 00/25135 en el que se requieren dos etapas de impregnación por separado. Por tanto, los resultados se pueden obtener más rápidamente y la sensibilidad de detección del analito es mayor. La expresión banda cromatográfica se use en el presente documento para hacer referencia a cualquier banda porosa de material capaz de transportar una disolución por medio de capilaridad. La banda cromatográfica puede ser apta para flujo lateral absorbente o no absorbente, pero preferentemente flujo lateral absorbente. Por la expresión flujo lateral no absorbente se entiende un flujo de líquido en el que todos los componentes disueltos o dispersos del líquido son transportados en tasas considerablemente iguales y con flujo relativamente inalterado en sentido lateral a través de la membrana opuesto a la retención preferente de uno o más componentes como tendría lugar con el flujo lateral absorbente. Las membranas aptas para flujo lateral absorbente incluyen papel, nitrocelulosa y nailon. Un ejemplo preferido es nitrocelulosa. Los marcadores se pueden unir a los ligandos del agente de dirección por medio de pre-mezcla del agente de dirección con los marcadores antes de añadir el agente de dirección (o por el contrario de la puesta en contacto con) la disolución de ensayo. No obstante, en algunas circunstancias, es preferible que el agente de dirección y los marcadores no se pre-mezclen debido a que dicha pre-mezcla provoca la precipitación del agente de dirección y de los marcadores. De este modo, se pueden añadir el agente de dirección y los marcadores por separado a (o se pueden poner en contacto por separado con) la disolución de ensayo. Se pueden añadir el agente de dirección y los marcadores a (o se pueden poner en contacto con) la disolución de ensayo considerablemente al mismo tiempo, o siguiendo cualquier orden. La disolución se ensayo se puede pre-incubar con el agente de dirección y los marcadores antes de que la disolución de ensayo entre en contacto con el extremo de contacto de la banda cromatográfica para garantizar la formación del complejo. El tiempo óptimo de pre-incubación depende de la proporción de reactivos y del... [Seguir leyendo]

1. Un método para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una banda cromatográfica que tiene un extremo de contacto para poner en contacto la disolución de ensayo y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la banda cromatográfica lejos del extremo de contacto, comprendiendo el resto de captura un miembro de un par de enlace ligando/anti-ligando capaz de unirse, por medio de una interacción de emparejamiento distinta de base de ácido nucleico, al analito o a uno de sus derivados, como el otro miembro del par de enlace ligando/antiligando; b) poner en contacto un agente de dirección, capaz de unirse al analito o a su derivado, con la disolución de ensayo para permitir la unión del agente de dirección al analito o a su derivado en la disolución de ensayo, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos; c) unir un marcador a cada uno de los dos o más ligandos del agente de dirección, d) poner en contacto el extremo de contacto de la banda cromatográfica con la disolución de ensayo para permitir que el analito, o uno de sus derivados, unido al agente de dirección marcado se desplace hasta la zona de captura por medio de la acción capilar y sea capturado por el resto de captura; y e) detectar la presencia del marcador en la zona de captura. 2. Un método para evaluar la presencia de un analito en la disolución de ensayo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una banda cromatográfica que tiene: i) un extremo de contacto para la puesta en contacto con la disolución de ensayo; ii) un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la banda cromatográfica lejos del extremo de contacto, comprendiendo el resto de captura un miembro de un par de enlace ligando/antiligando capaz de unirse, por medio de una interacción de emparejamiento distinta de base de ácido nucleico, al analito o a su derivado, como el otro miembro del par de enlace ligando/anti-ligando; y iii) un agente de dirección inmovilizado de forma que se pueda liberar en una zona de conjugado de la banda cromatográfica entre el extremo de contacto y la zona de captura, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos y siendo capaz de unirse al analito o a su derivado; b) poner en contacto una pluralidad de marcadores con la disolución de ensayo; c) poner en contacto el extremo de contacto de la banda cromatográfica con la disolución de ensayo para permitir que la disolución de ensayo viaje a través de la zona de conjugado hasta la zona de captura, liberando de este modo el agente de dirección desde la zona de conjugado de manera que cada uno de los dos o más ligandos del agente de dirección liberado queden unidos por un marcador y de manera que el agente de dirección liberado unido a los marcadores pueda viajar con el analito o con su derivado en la disolución de ensayo hasta la zona de captura y sea capturado en la zona de captura como parte de un complejo formado entre el resto de captura, el analito o su derivado, el agente de dirección y los marcadores; y d) detectar la presencia del marcador en la zona de captura. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los marcadores se encuentran inmovilizados de forma que se pueden liberar sobre la banda cromatográfica en lugar del agente de dirección, y el agente de dirección se pone en contacto con la disolución de ensayo en la etapa (b) en lugar de los marcadores. 4. Un método para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una banda cromatográfica que tiene un extremo de contacto para poner en contacto la disolución de ensayo y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la banda cromatográfica lejos del extremo de contacto, comprendiendo el resto de captura un miembro de un par de enlace ligando/anti-ligando capaz de unirse, por medio de una interacción de emparejamiento distinta de base de ácido nucleico, el analito o a uno de sus derivados, como el otro miembro del par de enlace ligando/antiligando; b) poner en contacto la banda cromatográfica con la disolución de ensayo para permitir que el analito o uno de sus derivados viaje hasta la zona de captura por medio de la acción capilar y sea capturado por medio del resto de captura; c) poner en contacto el extremo de contacto de la banda cromatográfica con una disolución que contiene un agente de dirección capaz de unirse al analito o a uno de sus derivados, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos y estando unido cada uno de los dos o más ligandos por medio de un 18   marcador, permitiendo que el agente de dirección marcado de la disolución viaje por medio de acción capilar hasta la zona de captura y se una al analito o a su derivado capturado en la zona de captura; y e) detectar la presencia del marcador en la zona de captura. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, en el que la unión de los marcadores a los ligandos del agente de dirección se lleva a cabo en la disolución de ensayo. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los marcadores están proporcionados por los agentes de marcaje que se añaden por separado a la disolución de ensayo en considerablemente el mismo instante en que el agente de dirección se pone en contacto con la disolución de ensayo. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente de dirección se pre-incuba con la disolución de ensayo antes de que los marcadores se unan al agente de dirección. 8. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que una pluralidad de marcadores está unida a al menos uno de los ligandos del agente de dirección. 9. Un estuche para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende: i) la banda cromatográfica que se define en la reivindicación 1; ii) por separado de la banda cromatográfica, un agente de dirección capaz de unirse al analito o a su derivado, no estando unido al analito o a su derivado, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos, y una pluralidad de agentes de marcaje cada uno unido a un ligando del resto de dirección, estando provisto cada agente de marcaje de un marcador. 10. Un estuche para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende: i) la banda cromatográfica que se define en la reivindicación 2; y por separado ii) una pluralidad de agentes de marcaje capaces de unirse a un ligando del resto de dirección, estando provisto cada agente de marcaje de un marcador. 11. Un estuche para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo que comprende: una banda cromatográfica que presenta i) un extremo de contacto para la puesta en contacto con la disolución de ensayo; ii) un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la banda cromatográfica lejos del extremo de contacto, comprendiendo el resto de captura un miembro de un par de enlace ligando/antiligando capaz de unirse, por medio de una interacción de emparejamiento distinta de base de ácido nucleico, al analito o a su derivado, como el otro miembro del par de enlace ligando/anti-ligando; y iii) un agente de dirección inmovilizado de forma que se pueda liberar en una zona de conjugado de la banda cromatográfica entre el extremo de contacto y la zona de captura, estando provisto el agente de dirección de una pluralidad de ligandos capaces de unirse al analito o a su derivado; y una pluralidad de agentes de marcaje capaces de unirse al ligando del resto de dirección, estando provisto cada agente de marcaje de un marcador, en el que los agentes de marcaje están inmovilizados de forma que se puedan liberar en una zona de conjugado de la banda cromatográfica entre el extremo de contacto y la zona de captura. 12. El estuche de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el agente de dirección marcado se encuentra en forma seca. 13. El estuche de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los agentes de marcaje se encuentran en forma seca. 14. El estuche de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente de dirección comprende un anticuerpo acoplado a una pluralidad de ligandos. 15. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente de dirección comprende: un resto principal capaz de unirse al analito o a su derivado; y un resto secundario capaz de unirse al resto principal, estando el resto secundario acoplado a una pluralidad de ligandos. 16. El estuche de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el resto principal y/o secundario del agente de dirección es un anticuerpo. 17. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, en el que cada agente de marcaje comprende un anticuerpo marcado. 19   18. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en el que el agente de marcaje comprende: un resto principal capaz de unirse a un ligando del agente de dirección; y un resto secundario marcado capaz de unirse al resto principal. 19. El estuche de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el resto principal y/o secundario del agente de marcaje es un anticuerpo. 20. El estuche de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, en el que el resto principal del agente de marcaje se encuentra marcado. 21. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en el que los marcadores comprenden marcadores detectables visualmente, preferentemente partículas coloreadas, o marcadores luminiscentes, preferentemente marcadores fluorescentes. 22. Un estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21, en el que los marcadores comprenden una enzima estable capaz de convertir un substrato en un producto coloreado, o en un producto luminiscente, preferentemente un producto fluorescente. 23. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en el que el analito es un analito de Chlamydia trachomatis (CT), o un antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg). 24. El uso del estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23 para evaluar la presencia de un analito en una disolución de ensayo. 25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el analito es un analito de CT, o un HBsAg.   21   22   23   24     26   27   28   29     31