Nueva variante de proteína de superficie (HbsAg) del virus de hepatitis B.

Oligo- o polipéptido que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que es una secuencia parcial de SEQ ID NO:

12 con al menos 70 aminoácidosconsecutivos de SEQ ID NO:12, en cuyo caso la secuencia parcial incluye las posiciones 73, 78, 112, 122 y 139 deSEQ ID NO:12; o

(b) un fragmento de un antígeno de HBs de un virus de hepatitis B según la figura 2, en cuyo caso el antígeno deHBs tiene en la posición 115 arginina, en posición 120 glutamina, en posición 154 leucina, en posición 164 valina yen posición 181 arginina y el fragmento comprende arginina 115, glutamina 120, leucina 154, valina 164 y arginina181.

Nueva variante de proteína de superficie (HbsAg) del virus de hepatitis B.

La invención se refiere a secuencias de un nuevo mutante o una variante de Hepatitis B surface Antigens (HBsAg) y a métodos para detectar esta variante de genoma y de proteína así como anticuerpos, de muestras de pacientes, 5 dirigidos hacia la misma.

Las nuevas secuencias conducen a 5 sustituciones de aminoácidos aún desconocidas en el antígeno de superficie de la hepatitis B (Hepatitis B surface Antigen, HbsAg) en las posiciones de aminoácido 115 a 181 de la secuencia de aminoácido del surface Antigens, en cuyo caso se encuentran 4 sustituciones en la región del a-determinante (aa 101 hasta aa 180) así como 1 sustitución en la inmediata vecindad de la misma (aa 181) .

La invención también se refiere a métodos de detección inmuno-químicos para la detección simultánea de esta nueva variante de HBV junto con variantes/subtipos conocidos así como al uso de las nuevas secuencias para la detección simultánea de anticuerpos específicos de HBV. Las determinaciones de antígeno o de anticuerpos pueden realizarse respectivamente en un método de ensayo de manera diferencial o no diferencial.

Finalmente, la invención también se refiere a la detección de los ácidos nucleicos correspondientes con ayuda de los llamados ensayos de ácido nucleico (por ejemplo, Polymerase Chain Reaction, PCR) con ayuda de cebadores (primer) adecuados así como al uso de las nuevas secuencias de aminoácidos para generar vacunas.

Como se sabe, el virus de la hepatitis B es el responsable de una gran cantidad de desarrollos patológicos desde infecciones suaves no aparentes hasta inflamaciones del hígado (hepatitis viral) causadas por infecciones virales, que son activas de manera crónica y tienen un desarrollo fulminante. La infección crónica con HBV representa un problema de salud global con un estimado de 400 millones de personas afectadas (Lee, N. Engl. J. Med. 337; 17331745 (1997) ) .

La inmunización activa (estimulando la respuesta de anticuerpo mediante administración de un antígeno) y la inmunización pasiva (producida inyectando anticuerpos preformados) se consideran como la profilaxis más adecuada para la infección con HBV que puede encontrarse frecuentemente a nivel mundial.

El HBV pertenece a los virus Hepadna y representa una partícula de virus con un diámetro de 42 nm que consiste en un núcleo y una envoltura. El genoma del virus es una secuencia de ADN anular, bicatenaria de aproximadamente 3200 nucleótidos que codifican al menos seis diferentes genes virales (Tiollais et al., Nature 317: 489-495 (1985) ) .

Se presentan cuatro marcos de lectura abiertos para la formación de la proteína viral.

En el gen S se encuentra la información para el HBV surface Antigen (HBsAg) , el cual también se llama small protein (S) . Además, también hay formas más grandes que se denominan proteína grande (large protein (L) ) y una proteína mediana (middle protein (M) ) . Todas las tres proteínas tienen en común la secuencia S-HbsAg que comprende 226 aminoácidos (Gerlich et al., Viral Hepatitis and Liver Disease, Hollinger et al., William-Wilkens, Baltimore, MD, páginas 121-134 (1991) ) . Las regiones de proteína de la small HBs también se denominan Pre-S1 y Pre-S2, comprenden 108 o 55 aminoácidos y están comprendidas ambas en la proteína L (389 aminoácidos) , mientras que la proteína M solo comprende Pre-S2 junto con el antígeno A (281 aminoácidos) . Las proteínas Pre-S tienen diferentes grados de glicosilación y llevan los receptores para el reconocimiento de las células hepáticas. A menos que se indique algo diferente, las posiciones de aminoácido en esta solicitud se refieren al antígeno S (226 aa) sin región Pre-S1 y sin región Pre-S2.

El gen C lleva la información para la proteína de nucleocápsida, Hepatitis B Core Antigen (HBcAg) . La traducción de esta proteína puede comenzar ya en la región pre-C y conduce a la formación de antígeno Be de hepatitis (HBeAg) . El HbeAg, en comparación con HbcAg, tiene un plegado y una inmunogenicidad diferentes. En contraste con HbcAg, HBeAg tiene lugar en forma libre en el suero y, al detectarse de manera positiva, se considera como un indicador de la formación de HBcAg y, por consiguiente, de la formación de partículas virales infecciosas.

La polimerasa de ADN de transcripción inversa que está presente en la partícula de virus se codifica por el gen P y 45 se discute la posibilidad de que el gen transactivador X tenga un papel causal en la aparición de carcinomas de células hepáticas primarias, asociadas con HBV.

El ciclo de replicación viral de HBV incluyen ARN pre-genómico intracelular que se transcribe inversamente en la nucleocápsida viral, al ADN. Puesto que la polimerasa de ADN que es intrínseca al HBV no posee ninguna capacidad de lectura de corrección (proof-reading capability) , se incorporan nucleótidos incorrectos a una frecuencia 50 relativamente alta. Como consecuencia, HBV exhibe una tasa de mutación que, a aproximadamente 1 nucleótido /10

000 bases /año de infección, corresponde a cerca de 10 veces la tasa exhibida por otros virus ADN (Blum, Digestion 56: 85-95 (1995) ; Okamoto et al., Jpn. J. Exp. Med. 57: 231-236 (1987) ) .

Además, también ocurren muy frecuentemente deleciones e inserciones (Carman et al., Lancet 341: 349-353 (1993) ) .

La variabilidad resultante de HBV se expresa, entre otras, en la ocurrencia de 9 subtipos serológicamente definidos (Courouce et al., Bibliotheca Haematologica 42: 1 (1976) y un total de al menos 6 genotipos diferentes que se denominan como A hasta F (Fig. 1) y presentan una dispersión geográfica. (Norder et al., J. Gen. Virol. 73: 31413145 (1992) , Norder et al., Virology 198: 489-503 (1994) ) .

Además, se ha descrito una serie de mutantes en los que se encuentran sustituidos, faltan o sobran 1 aminoácido o varios.

Aparte de las mutaciones que tienen lugar de manera natural (Cooreman et al., Hepatology 30: 1287-1292 (1999) , una administración de inmunoglobulinas de HBV y/o una terapia antiviral (por ejemplo, con lamivudina) puede ejercer una llamada presión de selección que conduce a un incremento en la ocurrencia de lo los llamados "escape mutantes" y puede incrementar de manera ostensible la probabilidad de aparición de mutantes de HBV (Terrault et al., Hepatology 28: 555-561 (1998) ; Tillmann et al., Hepatology 30: 244-256 (1999) ; Hunt et al., Hepatology 31: 10371044 (2000) .

No todas la mutaciones de HBV conducen a virus capaces de replicación y frecuentemente hay coexistencia con virus capaces de replicación, una situación que también limita la precisión de la secuenciación de ADN aislado o incluso conduce a un no reconocimiento de secuencias modificadas por PCR, trabajos de clonación con secuenciación subsiguiente, cuando éstas constituyen cuantitativamente < 10 % del ADN total (Cooreman et al., J. Biomed. Sci. 8: 237-247 (2001) .

Por consiguiente es ventajoso aislar mutantes con la identificación y caracterización subsiguientes de mutantes individuales que conducen a vacunas y agentes de diagnóstico mejorados.

La respuesta inmune después de una infección con HBV se dirige principalmente contra el llamado a-determinante, como una región de la proteína S que es común a todos los virus de hepatitis B y dicha región se localiza sobre la superficie de las partículas de virus (Gerlich et al., supra) y representa la parte más heterogénea del epítope de célula B del gen S.

De acuerdo con el actual estado del conocimiento, un total de al menos 5 epítopes que se solapan parcialmente en el a-determinante entre posiciones de aminoácido 101 y 180 se suponen sitios de enlace para anticuerpos (Fig. 1 y 2) tal como se ha podido mostrar usando anticuerpos monoclonales (Peterson et al., J. Immunol. 132: 920-927 (1984) ) .

Estos epítopes son principalmente epítopes de conformación compleja que se estabilizan mediante varios puentes de disulfuro. También se presentan algunos epítopes de secuencia que pueden producirse usando estructuras peptídicas cíclicas preparadas sintéticamente.

99 % de los llamados "anticuerpos protectores" que circulan en el suero después de una infección natural con HBV, se dirigen contra el a-determinante muy inmunogénico del HBV (Jilg, Vaccine 16: 65-68 (1998) .

En este hecho se fundamenta el uso difundido de la inmunización con vacunas... [Seguir leyendo]

1. Oligo- o polipéptido que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que es una secuencia parcial de SEQ ID NO:12 con al menos 70 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:12, en cuyo caso la secuencia parcial incluye las posiciones 73, 78, 112, 122 y 139 de SEQ ID NO:12; o

(b) un fragmento de un antígeno de HBs de un virus de hepatitis B según la figura 2, en cuyo caso el antígeno de HBs tiene en la posición 115 arginina, en posición 120 glutamina, en posición 154 leucina, en posición 164 valina y en posición 181 arginina y el fragmento comprende arginina 115, glutamina 120, leucina 154, valina 164 y arginina

181.

2. Oligo- o polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13.

3. Oligo- o polinucleótido que comprenden

(a) una secuencia de nucleótidos, que es una secuencia parcial de SEQ ID NO:1 con al menos 200 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO:1, en cuyo caso la secuencia parcial incluye las posiciones 218, 233, 335, 365 y 416 de SEQ ID NO:1,

(b) una secuencia de nucleótidos, que hibrida en condiciones severas de manera específica con un polinucleótido complementario a la secuencia SEQ ID NO:1, o

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un oligo- o polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2; o un oligo- o polinucleótido complementario a la misma.

4. Oligo- o polinucleótido según la reivindicación 3, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.

5. Vector o plásmido que contienen un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 o 4.

6. Célula que se transforma o se transfecta con un vector o plásmido según la reivindicación 5.

7. Célula que contiene un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 a 4 o un vector o un plásmido según la reivindicación 6.

8. Método para la preparación de un oligo-o polipéptido según una de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende cultivar una célula según la reivindicación 6 o 7 en condiciones adecuadas de tal modo que se exprese el oligo- o polipéptido.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque se obtiene el oligo- o polipéptido de las células y se separa de otros oligo- o polipéptidos.

10. Anticuerpo anti-idiotípico que representa una secuencia de aminoácidos tal como se define en una de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Kit de prueba para detectar virus de hepatitis B, el cual contiene

(i) un oligo- o polipéptido según una de las reivindicaciones 1 o 2; o

(ii) un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 o 4.

12. Péptido inmunogénico o mezcla de péptidos inmunogénicos que contiene uno o varios oligo- o polipéptidos según una de las reivindicaciones 1 o 2, solos o en conexión con inmunogenes de HBV conocidos.

13. Método para detectar anticuerpos, los cuales están dirigidos contra un antígeno de hepatitis B, caracterizado porque

(a) se incuba una muestra con un oligo- o polipéptido según una de las reivindicaciones 1 o 2 en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; y

(b) se detecta el complejo anticuerpo-antígeno que contiene el oligo- o polipéptido.

14. Método para detectar un ácido nucleico de hepatitis B, caracterizado porque (a) se incuba una muestra con un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 o 4 en condiciones que permiten la hibridación selectiva del oligo- o polinucleótidos con un ácido nucleico de hepatitis B en la muestra; y (b) se determina si se han formado complejos de polinucleótido que comprenden el oligo- o polinucleótido.

15. Método para detectar un ácido nucleico de hepatitis B, caracterizado porque (a) se incuba una muestra con al menos un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 o 4 en condiciones que permiten la hibridación selectiva del oligo- o polinucleótido con un ácido nucleico de hepatitis B en la muestra;

(b) se realiza una reacción en cadena de polimerasa; y (c) se determina si se amplificó un ácido nucleico.

16. Uso de un oligo- o polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 a 5 como cebador.

17. Uso de un oligo- o polinucleótidos según una de las reivindicaciones 3 o 4 como sonda.

18. Virus de hepatitis B aislado que tiene una a-determinante que corresponde a la secuencia de aminoácidos al 15 menos de las posiciones 115 a 181 según la reivindicación 1 (b) .

Figura 1: Secuencia de aminoácido del a-determinante de HBsAg de los diferentes genotipos de HBV en comparación con el nuevo mutante HDB 05Para cada genotipo se usó un genoma representativo como base y la aa-secuencia se derivó de la secuencia de nucleótidos

Resaltados en negrilla están las sustituciones de aminoácido que se derivan del HBV adw tipo silvestre

Fig. 2 Secuencia de nucleótidos del gen s del HBV adw del tipo silvestres conocido La proteína de superficie de HBV que codifica (surface antigen, HBsAg) y secuencia de aminoácidos resultante en código de tres letras o código de una letra (Coleman et al; WO 02/079217 A1)

Numeración consecutiva de nucleótido (nt) el antígeno de superficie codificante (excl. Pre S1 y y Pre S2 – región)

Figura 3 Secuencia de nucleótido del gen que codifica HBV surface antigen del HBV adw de tipo silvestre (la fila superior de nt 1 a nt 678) en comparación con la secuencia de nucleótido nt 127 a nt 588 secuenciada de la nueva variante HDB 05 (fila inferior, en las desviación de nucleótido resaltado en negrilla y puesto entre paréntesis, si las mutaciones no conduce a una sustitución de

Figura 4 Secuencia de nucleótido del gen S de la nueva variante de HBV HDB 05 (nt 127 a nt 588) del genoma que codifica HBV surface Antigen. Marcados en negrilla solo las desviaciones de nucleótido que conducen a una secuencia modificada de aminoácido

Figura 5 Secuencia de nucleótidos de S gen (nt 127 a 588) y secuencia de aminoácidos correspondiente (aa 43 a 196) de la nueva variante de HBV HDB 05 (resaltados en negrilla y subrayados están los aminoácidos que se presentan sustituidos en Los siguientes aa están sustituidos frente al HBV de tipo silvestre adw en la variante HDB 05 (x) : T 115 (R) , P 120 (Q) , S 154 (L) , E 164 (V) (Todos en la región de la a-determinante) así como Q 181 (R) (no en la región del a-determinante)

Figura 6 Comparación de las secuencias de aminoácidos de la a-determinante (aa 100 hasta aa 180) de la nueva variante HDB 05 (fila inferior) con el HBV de tipo silvestre adw (fila superior)

Secuencia –aa tipo silvestre adw: Y 100 Secuencia-aa variante HDB 05 Y

Los siguientes aa están sustituidos frente al HBV de tipo silvestre adw en la variante HDB 05 (x) : T 115 (R) , P 120 (Q) , S 154 (L) , E 164 (V) (Todos en la región de la a-determinante) así como Q 181 (R) (no en la región del a-determinante)