Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos.

Método para la purificación de células precursoras de oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende: obtener una muestra aislada de cerebro; seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida anteriormente y cultivar las POs en condiciones de proliferación, migración, movilidad o diferenciación celular. Además, la presente invención se refiere a los Pos obtenidos por el método de la invención y a las líneas celulares derivadas del mismo.

Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la neurobiología y la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método para la purificación de células precursoras de oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de ejemplares de edad madura.

Estado de la técnica

Los axones de muchas neuronas de vertebrados están aislados por la vaina de mielina, que aumenta enormemente la velocidad con la que el axón puede conducir el potencial de acción. Los oligodendrocitos son los responsables de la formación de la mielina en el sistema nervioso central (SNC). Estos oligodendrocitos envuelven el axón capa a capa con su propia membrana hasta formar una estrecha espiral, la vaina, que aísla la membrana del axón de manera que no se pierde apenas intensidad del impulso eléctrico. La vaina se interrumpe en los nódulos de Ranvier, que están espaciados regularmente y son puntos donde se concentran casi todos los canales de sodio. Estas excelentes características de la envuelta del axón hacen que la despolarización de la membrana en un nodo se extienda casi inmediatamente y de manera pasiva al siguiente. Así, el potencial de acción se propaga a lo largo del axón mielinizado saltando de nodo en nodo. Esta conducción tiene dos ventajas principales: los potenciales de acción viajan más rápido y la energía metabólica se conserva porque sólo se dispersa en pequeñas regiones de la membrana axonal en los nódulos de Ranvier.

La importancia de la mielinización viene demostrada por las enfermedades desmielinizantes, como la esclerosis múltiple, en la que la vaina de mielina en algunas regiones del SNC es destruida por algún mecanismo todavía desconocido.

Los oligodendrocitos son células post-mitóticas, totalmente diferenciadas, que no se dividen in vivo, lo cual dificulta su cultivo in vitro a largo plazo (Verity y cols, 1993 J Neurochem. 60(2):577-87). Los POs, que tienen capacidad de proliferar, migrar y de diferenciarse, ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos moleculares y celulares de diferenciación morfofuncional, así como los procesos de mielinización, desmielinización y remielinización in vitro, y pueden ser una fuente para promover la mielinización y/o la remielinización in vivo, con especial importancia en patologías desmielinizantes.

Todas las células del SNC provienen de las células troncales neuroepiteliales. Éstas dan lugar tanto a las neuronas como a la macroglia. Las células gliales son los astrocitos y los oligodendrocitos, que se distinguen por varias características. Los oligodendrocitos son de menor tamaño y presentan mayor densidad en su núcleo y su citoplasma. Carecen de filamentos intermedios y glucógeno en su citoplasma y presentan un elevado número de microtúbulos (Peters y cols, 1991, Anat Rec; 229(3):384-98).

El oligodendrocito puede tener muchos procesos o extensiones celulares y cada una de ellas contacta y envuelve repetidas veces una porción de axón neuronal. Cuando estas envueltas se condensan, la espiral de membrana forma la vaina de mielina. En el mismo axón, los segmentos de mielina adyacentes pertenecen a distintos oligodendrocitos y cada unidad de mielina termina cerca de un nódulo de Ranvier (Bunge, 1968, Physiol Rev. 48(1):197-251).

Antes de madurar hasta formar la vaina de mielina, los oligodendrocitos pasan por varias etapas de desarrollo definidas por la expresión de receptores de superficie específicos y por su respuesta a distintos factores de crecimiento, entre otras moléculas. Así, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, del inglés "platelet-derived growth factor") se asocia tanto a la autorrenovación como a la generación de oligodendrocitos (Richardson y cols, 1988, Nature. 9; 333(6173):562-5.; Raff y cols, 1989 Development. 105(3):595-603; Noble y cols, 1988 Nature. 9; 333(6173):560-2).

Así, los POs se caracterizan por expresar Nestina⁺, A2B5⁺, NG2/AN2⁺, plp-dm20⁺, PDGFRα⁺, GD3⁺, CNP⁺. Posteriormente los POs dan lugar a los preoligodendrocitos que expresan los mismos marcadores excepto Nestina y además presentan O4 (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci. 5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res Brain Res Rev. 49(2):227-41).

El inicio de la diferenciación terminal (oligodendrocito inmaduro) se asocia a la síntesis y a la presencia en la superficie celular de galactosilceramidas (GalC), que reconoce el anticuerpo contra O1.

Los oligodendrocitos maduros expresan la proteína básica de la mielina (MBP) y la proteína proteolípida (PLP) y sintetizan la membrana de mielina. Otros marcadores moleculares expresados por los oligodendrocitos maduros son O4⁺, RIP⁺, GalC⁺, ACNP⁺, MAG⁺ (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci. 5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res Brain Res Rev. 49(2):227-41).

Aunque la mayoría de los estudios de los progenitores O-2A y los oligodendrocitos maduros se han llevado a cabo en roedores, tanto células O-2A, como células multipolares A2B5⁺/O4⁺, así como oligodendrocitos maduros O1⁺ han sido identificados en cerebro fetal humano (Rivkin y cols, 1995, Ann Neurol; 38(1):92-101).

En el adulto, tanto los los oligodendrocitos como los POs se distribuyen de manera homogénea por todo el SNC, principalmente en la sustancia blanca, pero también en la sustancia gris.

La proliferación y diferenciación de los POs (incluyendo el subsiguiente proceso de mielinización) siguen un gradiente caudorrostral a lo largo del tubo neural. Cada paso del proceso de diferenciación, desde la fase de precursor hasta la de oligodendrocito maduro, puede ser identificado por cambios en la morfología celular y en la expresión de marcadores inmunocitoquímicos, lo que se acompaña de un descenso paulatino de la capacidad proliferativa y migratoria (Almazán, G y cols, 2001, Microsc Res Tech. 15; 52(6):753-65; Rowitch, D, 2004, Nat Rev Neurosci. 5(5):409-19). La expresión de estos marcadores sirve incluso para diferenciar entre diversas poblaciones de oligodendrocitos. De hecho, se ha propuesto la existencia de dos poblaciones distintas de POs: una población dependiente del PDGF, población que denominamos PDGFRα⁺, y otra independiente de este factor de crecimiento, población plp/dm20⁺ (Spassky, N y cols, 2000, Glia. 15; 29(2):143-8; Spassky, N y cols, 1998, J Neurosci. 15;18(20):8331-43.; Pringle, NP y Richarson, WD, 1993, Development.117(2):525-33.; Le Bras, B, 2005, Int J Dev Biol. 49(2-3):209-20). Ambas poblaciones de oligodendrocitos experimentan un variado patrón de migración para colonizar todo el SNC durante el desarrollo.

Durante el desarrollo, los oligodendrocitos se generan a partir de POs. Este tipo celular se ha descrito en el SNC de humanos adultos y constituye una fuente celular interesante para su uso en terapias regenerativas para el tratamiento de lesiones desmielinizantes, como por ejemplo la esclerosis múltiple. Este potencial resulta especialmente interesante, porque se ha demostrado que los axones pueden ser mielinizados a lo largo de toda la vida de las neuronas, incluso después de haber sufrido un proceso de desmielinización (Setzu y cols., 2004, Glia 45:307-311). En respuesta al daño desmielinizante, los POs endógenos migran hacia la zona de lesión, pero no son capaces de penetrar y remielinizar de manera efectiva, sino que se quedan en la periferia o, si penetran en la zona de lesión, mueren (Chang y cols, 2002, N Engl J Med. 346:165-173).

El estudio de los POs durante el desarrollo embrionario ha permitido conocer los mecanismos moleculares que regulan la migración, proliferación y diferenciación de este tipo celular. Sin embargo, existen pocos datos acerca de la biología de los POs en cerebro adulto, ya que hasta la fecha sólo se han podido aislar de manera eficiente los POs de embriones o neonatos. Por tanto, no se ha podido estudiar cuál es la fisiología de estos POs adultos, sus similitudes y divergencias con lo visto en POs embrionarios o postnatales tempranos.

La eficacia de cualquier proceso de purificación de un tipo celular dado es inversamente proporcional al tiempo que transcurre desde la obtención de la muestra hasta el momento de la siembra de las células obtenidas en la combinación de un medio de cultivo y un sustrato que permitan su supervivencia. La purificación de POs a partir de tejido embrionario... [Seguir leyendo]

1. Un método de obtención de POs a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende:

2. El método según la reivindicación anterior donde el paso (b) comprende la digestión enzimática de la muestra obtenida según (a).

3. El método según la reivindicación 2 donde el paso (b) comprende:

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 donde la enzima empleada para la digestión enzimática del paso (b) es la papaína.

5. El método según la reivindicación 4 donde la concentración de papaína empleada en el paso (b) es de entre 50 y 200 microgramos/mililitro.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde la concentración de papaína empleada en el paso (i) es de entre 150 y 200 microgramos/mililitro.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 50 y 120 microgramos/mililitro.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 70 y 100 microgramos/mililitro.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (b) es de entre 2 y 22 minutos.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (i) es de entre 3 y 7 minutos.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 8 y 18 minutos.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el paso (b) comprende una digestión enzimática con DNasa.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el mamífero tiene más de dos semanas de edad.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el mamífero tiene entre 15 días y 9 meses de edad.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el mamífero tiene entre 15 días y 6 meses de edad.

16. POs obtenibles por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1- 15.

17. Una línea celular de POs obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o por la inmortalización celular mediante transfección génica de los POs de la reivindicación 16.

18. Método de descubrimiento de fármacos que comprende: