MÉTODO DE ELECTROFORESIS Y DISPOSITIVO PARA SEPARAR OBJETOS.

Un método de electroforesis para separar objetos (10) en un fluido (9) contenido en un canal (2) de separación,

comprendiendo el método:

aplicar un campo eléctrico (E) a lo largo del canal (2) de separación, teniendo el campo eléctrico un perfil de campo, y causando de este modo que al menos alguno de los objetos (10) se muevan en relación al fluido (9); variar el campo eléctrico (E) aplicado para ajustar el perfil de campo en relación al canal (2) de separación, causando de este modo que los objetos (10) se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza eléctrica (Fe) debida al campo eléctrico y una fuerza hidrodinámica (Fh) debida al fluido; caracterizado porque el perfil del campo eléctrico es conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto (10), que resulta de la combinación de la fuerza eléctrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinámica ejercida por el fluido, es tal que la anchura de cada banda separada permanece sustancialmente constante con el tiempo; y

en el que el fluido (9) y el canal (2) de separación están sustancialmente estacionarios uno con respecto al otro

Metodo de electroforesis y dispositivo para separar objetos.

Esta invención se refiere a un metodo y dispositivo para llevar a cabo la separación electroforetica de objetos en un fluido. La tecnica descrita elimina la difusión de bandas y consigue una separación rapida, de alta resolución.

La electroforesis se refiere al movimiento de objetos cargados a traves de un fluido bajo la influencia de un campo electrico. Este fen6meno se puede usar para separar objetos segun sus propiedades electricas e hidrodinamicas, y estan en uso generalizado varias tecnicas para explotar esto. Los objetos a ser separados, comunmente protefnas u otras biomoleculas, se suspenden típicamente en un fluido tal como una disolución amortiguadora o un gel. Una pequefa sección de la disolución que contiene los objetos se coloca en el principio de un canal de separación que contiene un fluido o gel y posteriormente se genera un campo electrico constante a lo largo del canal. Bajo la influencia de este campo, dichos objetos empiezan a moverse hacia el extremo opuesto del canal. Mientras migran a traves del fluido, experimentan una fuerza hidrodinamica diferencial que depende de su forma y tamafo. Debido a esta diferente fuerza hidrodinamica aplicada a ellos, los objetos se mueven con diferente velocidad terminal dependiendo de sus caracterfsticas individuales, y por tanto se separan y formas "bandas". Debido a sus diferentes velocidades terminales, la distancia entre las bandas aumenta con el tiempo.

Una banda es esencialmente un grupo de objetos que tienen propiedades electricas e hidrodinamicas similares. Una de las desventajas clave de la electroforesis es el hecho de que las bandas, mientras se mueven a su velocidad terminal, sufren difusión termica. Esto hace que las bandas se ensanchen con el tiempo, reduciendo la resolución de la separación.

Se revisan diversas implementaciones conocidas de la electroforesis en "Cyclic electrophoretic and chromatographic separation methods", Eijkel et al, Electrophoresis 2004, 25, 243-252.

El documento US-A-5126022 describe un dispositivo de electroforesis en el que se aplica una pluralidad de campos electricos para mover moleculas cargadas a traves de un medio. Mezclas de moleculas cargadas son arrastradas a traves del gel por la fuerza de los campos electricos. Los campos se activan preferiblemente de manera simultanea o secuencial uno despues de otro a diversas velocidades, para crear distribuciones de fuerza complejas u ondas de campo en movimiento a lo largo del medio de separación. Las moleculas cargadas capaces de moverse rapidamente a traves del gel seran movidas a lo largo por las ondas de campo en movimiento mas rapidas y seran separadas de moleculas en movimiento mas lentas.

Hay tambien un numero de variantes al metodo de electroforesis convencional que intentan limitar la difusión termica.

Un metodo tal es el Enfoque Isoelectrico (IEF, por sus siglas en ingles) que emplea un gradiente de pH en el canal de separación. Mientras los objetos se mueven a traves del fluido bajo la influencia de un campo electrico constante, su carga aparente cambia debido al pH cambiante a lo largo del canal. Cada objeto, dependiendo de sus caracterfsticas de carga, se mueve hasta un punto donde su carga aparente es cero. Esto se llama el "punto isoelectrico". En ese punto el objeto deja de moverse, ya que alcanza una posición de equilibrio. Cada objeto con diferentes caracterfsticas de carga se detiene en un punto diferente a lo largo del canal, y por tanto tiene lugar una separación de los objetos. Las bandas de los objetos pueden ser entonces detectadas e investigadas, por ejemplo por generación de imagenes.

La ventaja de este metodo es la eliminación de la difusión termica, y la desventaja es la limitada precisión del gradiente de pH. Otra desventaja son los tiempos de separación aumentados (típicamente muchas horas) .

Se describe otra variante de electroforesis en el documento US-A-2002/0043462. Las partículas son separadas aplicando una primera fuerza que resulta del flujo del amortiguador a traves de la camara, al que se opone un gradiente de campo electrico. La forma del campo electrico estatico es tal que las partículas se separan en bandas a lo largo de la camara. Las bandas representan posiciones de equilibrio en las que la fuerza neta sobre cada molecula es cero. Una vez que se forman las bandas, el campo electrico aplicado puede ser modificado para manipular las bandas, por ejemplo moviendo una banda de interes hasta un punto de salida. Sin embargo, como en el caso de otros sistemas conocidos, el dispositivo depende de un flujo constante de amortiguador a traves de la camara para imponer la fuerza hidrodinamica apropiada sobre cada partícula y conseguir por tanto una separación exitosa. Esto conduce a varios problemas.

En primer lugar, el equipo de bombeo y monitorización requerido para conseguir el altamente preciso flujo de lfquido a traves del canal conduce a una infraestructura potencialmente cara y complicada. Como resultado, los sistemas son típicamente costosos y pueden no ser fiables, comprendiendo varios componentes mecanicos complejos. La precisión del flujo de amortiguador es esencial para la precisión y resolución del dispositivo.

En segundo lugar, un problema comun asociado al uso de lfquidos que fluyen, y que se experimenta mucho en procedimientos de cromatograffa lfquida de alta resolución (HPLC) que usan flujo impulsado por presión, es que el lfquido interactua con las paredes del canal. Como resultado, el lfquido no fluye con una velocidad constante a

traves de la sección transversal del canal, sino que mas bien se mueve lentamente en la parte adyacente a las paredes y mas rapido hacia el centro del canal. Esto crea un frente de velocidad parab6lico, lo que afecta directamente a la forma de las bandas de las moleculas separadas. Cuanto mayor es la desviación desde un frente de velocidad constante, mas anchas se hacen las bandas, reduciendose así la resolución en el dispositivo. El proceso de separación puede ser acelerado aumentando el caudal del amortiguador. Esto es porque el tiempo empleado por las moleculas para alcanzar su posición de equilibrio se acorta, y de ahf que la separación se complete mas rapidamente. En un primer metodo, aumentar el caudal tambien debe estrechar las bandas estacionarias, porque las fuerzas hidrodinamicas y electricas ejercidas son mas grandes. Esto darfa como resultado una resolución mejorada.

Sin embargo, mientras el caudal es aumentado, el perfil de flujo parab6lico se hace mas acentuado, tendiendo a suprimir la mejora en resolución esperada.

La electroforesis convencional implica a menudo el uso de geles como fluido de separación. La relativamente alta viscosidad reduce la difusión y por tanto mejora la resolución. Sin embargo, es diffcil, si no imposible, usar geles con tecnicas que requieren flujo de amortiguadores (tales como los dos metodos mencionados anteriormente) porque los geles, de manera general, no fluyen facilmente.

Lo que se necesita es una tecnica que controle de manera eficaz la difusión termica y que elimine la necesidad de un flujo constante del fluido de separación a traves del aparato. Tal metodo debe conseguir una rapida separación y una alta resolución.

De acuerdo con la presente invención, un metodo de electroforesis para separar objetos en un fluido contenido en un canal de separación comprende los rasgos de la reivindicación 1.

Ademas, de acuerdo con la presente invención, un dispositivo de electroforesis para separar objetos comprende los rasgos de la reivindicación 27.

Se apreciara que el termino "fluido" se usa aquf para describir cualquier medio de separación apropiado. Por ejemplo, el fluido podrfa ser un lfquido o un gel capaz de generar fuerzas friccionales o hidrodinamicas sobre un objeto en movimiento.

Variando el campo electrico aplicado en relación al canal de separación desde sustancialmente el comienzo del proceso de separación (a diferencia de despues de que se formen las bandas) , los objetos pueden ser separados en bandas sin necesidad de un flujo de fluido a traves del canal de separación. El campo electrico aplicado establece un perfil de campo variante en el tiempo, lo que consigue la separación electroforetica forzando a las partículas a moverse a traves del fluido, que puede ser por tanto estacionario en sí mismo. Se debe hacer notar que el campo electrico no es constante (con respecto al canal) a lo largo de al menos una parte del perfil del campo. En otras palabras,... [Seguir leyendo]

1. Un metodo de electroforesis para separar objetos (10) en un fluido (9) contenido en un canal (2) de separación, comprendiendo el metodo:

aplicar un campo electrico (E) a lo largo del canal (2) de separación, teniendo el campo electrico un perfil de campo, y causando de este modo que al menos alguno de los objetos (10) se muevan en relación al fluido (9) ;

variar el campo electrico (E) aplicado para ajustar el perfil de campo en relación al canal (2) de separación, causando de este modo que los objetos (10) se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza electrica (Fe) debida al campo electrico y una fuerza hidrodinamica (Fh) debida al fluido;

caracterizado porque el perfil del campo electrico es conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto (10) , que resulta de la combinación de la fuerza electrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinamica ejercida por el fluido, es tal que la anchura de cada banda separada permanece sustancialmente constante con el tiempo; y en el que el fluido (9) y el canal (2) de separación estan sustancialmente estacionarios uno con respecto al otro.

2. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 1, en el que el campo electrico varfa con respecto al canal (2) de separación a lo largo del perfil del campo.

3. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el perfil del campo electrico tiene un gradiente que es distinto de cero.

4. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera delas reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es variado de tal manera que el perfil del campo se mueve en relación al canal (2) de separación.

5. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 4, en el que el perfil del campo permanece por lo demas sin cambios mientras se mueve en relación al canal (2) de separación.

6. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es variado de tal manera que el perfil del campo electrico se traslada a lo largo del canal (2) de separación.

7. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico aplicado es variado de tal modo que, una vez que los objetos (10) se han separado en bandas, cada banda se mueve con una velocidad terminal distinta de cero en relación al canal (2) de separación.

8. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 7, en el que la velocidad terminal de cada banda es sustancialmente la misma.

9. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico aplicado es de la forma

donde x es una coordenada espacial, típicamente a lo largo del canal de separación, t es una coordenada temporal, n y k son cada uno numeros reales y n no es cero.

10. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el perfil del campo electrico es monot6nico con respecto a la distancia a lo largo del canal.

11. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas las etapas de mezclar los objetos (10) a ser separados con el fluido (9) y colocar la mezcla en el canal (2) de separación.

12. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademas las etapas de colocar el fluido en el canal de separación e insertar una muestra en el canal de separación, comprendiendo la muestra al menos objetos (10) a ser separados.

13. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 12, en el que la muestra comprende ademas el fluido (9) .

14. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de detectar las bandas.

15. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que

comprende ademas la etapa de modificar el campo electrico, despues de que los objetos (10) se han separado en bandas, para ajustar el espaciado entre las bandas, el posicionamiento de las bandas o la resolución de las bandas.

16. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 15, en el que el campo electrico es modificado por cambios en su dependencia del tiempo y/o su intensidad.

17. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de extraer una banda de interes del canal (2) de separación despues de que los objetos

(10) se han separado.

18. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de hacer oscilar el campo electrico, causando que el movimiento de las bandas se invierta en dirección, moviendose así las bandas hacia delante y hacia atras a lo largo del canal (2) de separación.

19. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el canal (2) de separación es un bucle cerrado y el campo electrico aplicado es peri6dico alrededor del bucle.

20. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es aplicado por medio de una pluralidad de electrodos (3) dispuestos a lo largo del canal (2) de separación.

21. Un metodo de electroforesis segun la reivindicación 20, en el que al menos algunos de la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separación por una capa de material (11) electricamente resistivo.

22. Un metodo de electroforesis segun la reivindicación 21, en el que el material (11) electricamente resistivo es un semiconductor.

23. Un metodo de electroforesis segun la reivindicación 22, en el que el semiconductor es un semiconductor dopado.

24. Un metodo de electroforesis segun la reivindicación 23, en el que el material electricamente resistivo es silicio dopado.

25. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separación de tal modo que no conduce corriente entre los electrodos y el fluido.

26. Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los objetos (10) a ser separados comprenden biomoleculas, protefnas, polfmeros, ADN, ARN o celulas biológicas.

27. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos, comprendiendo el dispositivo:

un canal (2) de separación que, en el uso, contiene un fluido (9) y los objetos (10) a ser separados;

medios para aplicar un campo electrico (E) a lo largo del canal (2) de separación, teniendo el campo electrico un perfil de campo por el cual se causa que los objetos (10) en el canal (2) de separación se muevan en relación al fluido;

un controlador (4) adaptado en el uso para aplicar y variar el campo electrico aplicado, para ajustar el perfil del campo electrico en relación al canal (2) de separación, por lo cual se causa que los objetos en el canal de separación se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza electrica (Fe) debida al campo electrico y una fuerza hidrodinamica (Fh) debida al fluido;

caracterizado porque el controlador (4) esta adaptado ademas para aplicar un perfil de campo electrico conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto, que resulta de la combinación de la fuerza electrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinamica ejercida por el fluido, es tal que cada banda separada sufre una difusión espacial sustancialmente cero; y en el que, en el uso, el fluido contenido en el canal de separación es sustancialmente estacionario en relación al canal de separación.

28. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 27, en el que el campo electrico varfa con respecto al canal (2) de separación a lo largo del perfil del campo.

29. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 27 o la reivindicación 28, donde el perfil del campo electrico tiene un gradiente que es distinto de cero.

30. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que el controlador esta adaptado ademas para mover el perfil del campo electrico en relación al canal (2) de separación.

31. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 30, en el que el controlador esta adaptado ademas para mantener el perfil del campo sin cambios mientras se mueve en relación al canal (2) de separación.

32. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 30 o la reivindicación 31, en el que el controlador esta adaptado ademas para trasladar el perfil del campo electrico a lo largo del canal (2) de separación.

33. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que el controlador esta adaptado ademas para variar el campo electrico aplicado de tal modo que, una vez que los objetos (10) se han separado en bandas, cada banda se mueve con una velocidad terminal distinta de cero en relación al canal (2) de separación.

34. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 33, en el que la velocidad terminal de cada banda es sustancialmente la misma.

35. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, en el que el campo electrico aplicado es de la forma

donde x es una coordenada espacial, típicamente a lo largo del canal de separación, t es una coordenada temporal, n y k son cada uno numeros reales y n no es cero.

36. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35, en el que el perfil del campo electrico es monot6nico con respecto a la distancia a lo largo del canal.

37. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, en el que los medios para aplicar un campo electrico comprenden una pluralidad de electrodos (3) dispuestos a lo largo del canal (2) de separación.

38. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 37, en el que al menos algunos de la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separación por una capa de material (11) electricamente resistivo.

39. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 38, en el que el material electricamente resistivo es un semiconductor.

40. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 39, en el que el material electricamente resistivo es un semiconductor dopado.

41. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 40, en el que el material resistivo es silicio dopado.

42. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun las reivindicaciones 37 a 41, en el que los electrodos

(3) estan espaciados del interior del canal de separación de tal modo que no conduce corriente entre los electrodos y el fluido (9) .

43. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, en el que los electrodos (3) comprenden tinta conductora impresa en o adyacente al canal de separación o material resistivo.

44. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 43, en el que canal (2) de separación es un capilar.

45. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 44, en el que canal (2) de separación es rectilfneo.

46. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 45, en el que el canal (2) de separación esta en la forma de un bucle cerrado.

47. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 46, en el que el canal (2) de separación es circular.

48. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 47, en el que el canal (2) de separación esta grabado en un sustrato.

49. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 48, en el que el dispositivo es un dispositivo microflufdico.

50. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 49, que comprende ademas un detector (6) adaptado para detectar bandas en el canal de separación.

51. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 50, en el que el detector (6) esta adaptado para generar imagenes de bandas en el canal de separación.

52. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 51, en el que el canal de separación esta provisto de al menos un orificio (7) de entrada para la inserción de una muestra en el canal de separación, comprendiendo la muestra al menos objetos a ser separados.

53. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 52, en el que el canal de separación esta provisto de al menos un orificio (8) de salida para la extracción de bandas de objetos del 10 canal de separación.

54. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 53, que comprende una pluralidad de canales (2) de separación, estando provisto cada canal de separación de medios para aplicar un campo electrico y un controlador.

55. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 54, en el que el campo electrico 15 aplicado a cada canal de separación es el mismo.

56. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicación 54 o la reivindicación 55, en el que el campo electrico aplicado a cada canal de separación es controlado por el mismo controlador.

57. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 28 a 56, en el que los objetos a ser separados comprenden biomoleculas, protefnas, polfmeros, ADN, ARN o celulas biológicas.