Electroforesis en gel bidimensional de emisión de resolución temporal acumulativa.

Método de adquisición de imágenes de electroforesis en gel mono y bidimensional,

caracterizado por

excitar un fluorocromo unido a una proteína con un dispositivo de exploración de láser pulsado para proporcionar mediciones mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia para la detección y cuantificación de proteínas a un nivel píxel por píxel y

utilizar un ajuste multiexponencial de la curva de decaimiento de fluorescencia para separar la fluorescencia que se origina de la especie de proteína marcada con el fluorocromo de la fluorescencia que se origina de otras fuentes seleccionadas del grupo que consiste en, tales como, la propia matriz de gel, disoluciones o partículas presentes en el gel, o de efectos de dispersión, para la posterior sustracción del fondo.

Electroforesis en gel bidimensional de emisión de resolución temporal acumulativa.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método y a una nueva tecnología de adquisición de imágenes para la detección y cuantificación en gel de proteínas. Esta nueva plataforma, denominada electroforesis en gel bidimensional de emisión de resolución temporal acumulativa (CuTEDGE) , utiliza diferencias en los tiempos de vida de fluorescencia para diferenciar entre fluorescencia de marcadores proteicos específicos y fluorescencia de fondo no específica, que da como resultado una espectacular mejora tanto en la sensibilidad como en el rango dinámico en comparación con la tecnología existente.

Antecedentes de la invención "Proteómica" se refiere al estudio del complemento proteico del genoma (proteoma) , un término acuñado por Marc Wilkins en 1994. Durante la pasada década, se han desarrollado y utilizado muchas metodologías para la cuantificación simultánea de miles de proteínas en una célula o un tejido para, por ejemplo, el descubrimiento de biomarcadores o estudios mecanísticos de procesos celulares. La electroforesis en gel bidimensional (2-DGE) fue el primer método que se adaptó para el análisis proteómico, y todavía constituye una pieza maestra en la investigación proteómica. El método de 2-DGE implica la separación de muestras proteicas complejas según la carga en la primera dimensión y según el tamaño en la segunda dimensión, dando como resultado un mapa 2-D de manchas de proteína en el que de manera ideal cada mancha corresponde a una única especie de proteína. Las manchas de proteína se visualizan entonces con tinciones de proteínas que se unen estequiométricamente a las proteínas, proporcionando así una tercera dimensión que corresponde a la abundancia de proteínas, lo que facilita el análisis proteómico cuantitativo.

Se han tratado los problemas de grandes variaciones de un gel a otro asociados con la técnica de 2-DGE original a través de la incorporación de un patrón interno, tal como las técnicas de electroforesis diferencial en gel (DIGE) y de patrón interno marcado con Alexa (ALIS) . Ambos conceptos se basan en proteínas de muestra y proteínas de patrón interno que se marcan con fluorocromos separados espectralmente, y se separan conjuntamente en el mismo gel de 2-DGE. Mediante normalización radiométrica, pueden corregirse las variaciones entre geles, mejorando así enormemente los aspectos cuantitativos y el poder estadístico global de la técnica de 2-DGE.

La principal restricción que queda en la metodología de 2-DGE actual son las limitaciones en la sensibilidad de detección. El hecho de que las abundancias de proteínas en muestras biológicas puedan abarcar hasta doce órdenes de magnitud impone grandes exigencias tanto sobre la sensibilidad como sobre el rango dinámico de las tinciones de proteínas usadas en 2-DGE cuantitativa. Para este fin, las tinciones fluorescentes con rangos dinámicos de 3-4 órdenes de magnitud han sustituido el uso de métodos de tinción colorimétrica clásicos, tales como tinciones de plata y Commassie con rangos dinámicos limitados normalmente a 1-2 órdenes de magnitud (figura 1) .

Están disponibles colorantes fluorescentes tanto para el marcaje covalente antes de la separación mediante 2-DGE (por ejemplo CyDyes™, colorantes Alexa) , así como para procedimientos de tinción tras electroforesis, no covalentes (por ejemplo, SYPRO Ruby™, Deep Purple™) . Sin embargo, incluso las sondas fluorescentes de mejor rendimiento para la visualización de proteínas actualmente en el mercado sólo cubren una parte muy pequeña del posible rango fisiológico puesto que las abundancias de proteínas fisiológicas oscilan entre unas cuantas moléculas hasta concentraciones micromolares, mientras que los límites de detección para el método de DIGE mínima del estado de la técnica se limitan normalmente a nanogramos de proteína (figura 1) .

En la utilización actual de fluorescencia para la detección y cuantificación de proteínas en 2-DGE, la excitación del flúor y la medición de la emisión resultante se producen simultáneamente. Siendo eficaz en cuanto al tiempo y práctico desde un punto de vista técnico, este enfoque se utiliza tanto en dispositivos de exploración de fluorescencia como en instrumentos de adquisición de imágenes de 2-DGE basados en cámaras CCD. Sin embargo, las mediciones directas de fluorescencia no utilizan el potencial completo de estos fluorocromos. Las muestras biológicas contienen numerosos componentes autofluorescentes, y la propia matriz de poliacrilamida emite fluorescencia de fondo en cierto grado. Para optimizar la relación señal a ruido, por tanto es esencial disminuir las perturbaciones de fluorescencia de fondo y autofluorescencia.

En la tecnología de 2-DGE actual, se realizan matemáticamente intentos de eliminar el fondo resultante a través de algoritmos de software usados en el análisis cuantitativo asistido por ordenador tras la electroforesis. Sin embargo, se ha mostrado anteriormente que la mayoría de estos algoritmos de sustracción y corrección de fondo alteran los datos e introducen una varianza adicional en la cuantificación de volúmenes de manchas de proteínas, así como contribuyen a una distribución no normal, sesgada (1-4) .

A través de fluorescencia de resolución temporal (TRF) , puede derivarse el origen de un fotón a través de separación de las curvas de decaimiento de las diversas especies fluorescentes presentes en un píxel dado. La TRF se usa actualmente en varias aplicaciones en campos relacionados, principalmente aplicaciones en microscopía para visualizar la localización, dinámica de plegamiento o movimiento de proteínas en disolución (5, 6) . Varios de los fluorocromos usados actualmente en 2-DGE se han utilizado en aplicaciones de fluorescencia de resolución temporal en estos campos relacionados (por ejemplo, CyDyes™ disponible de GE Healthcare, Uppsala, Suecia, y colorantes Alexa así como quelatos de rutenio tales como SYPRO Ruby™, ambos disponibles de Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU. (7, 8) ) . Sin embargo, la falta de esta característica en equipo moderno de adquisición de imágenes mediante 2-DGE está prohibiendo actualmente el uso y el desarrollo de TRF en 2-DGE.

Descripción de la técnica relacionada La mayoría de la técnica anterior en el campo se refiere a técnicas transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para el estudio de interacciones intermoleculares, estabilidad molecular o cambios conformacionales intramoleculares, y parte se refiere al uso de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) . Éstas incluyen la monitorización de productos de reacción en cadena polimerizados (PCR) (Rintamaki S. et al, Journal of microbiological methods, (agosto de 2002) Vol. 50, n.º 3, págs. 313-8) , y otros para la asignación de bases en la secuenciación de ADN (Lassiter S J et al, Analytical chemistr y , 1 de noviembre de 2000, Vol. 72, n.º 21, págs. 5373-82) . Estos autores han modificado la cabeza del microscopio en un secuenciador automático de ADN para permitir mediciones de tiempo de vida de fluorescencia de resolución temporal en el infrarrojo cercano. Por consiguiente, el diseño, las capacidades y la utilización de este instrumento fueron de una naturaleza completamente diferente a la de la invención en el presente documento. Las modificaciones del instrumento realizadas por este grupo se diseñaron para fines de clasificación con el fin de mejorar la precisión y velocidad de secuenciación de ADN. En esencia, se utilizaron imágenes de tiempo de vida para distinguir entre dos fluorocromos con diferentes tiempos de vida, que representan la presencia de diferentes fragmentos de ADN que se fraccionaron a través de electroforesis en gel plano. En estudios de seguimiento, los autores ampliaron la tecnología de secuenciación a una plataforma de microchip de polímero con un fin similar (Llopis S D et al, Electrophoresis, noviembre de 2004, Vol. 25, n.º 21-22, págs. 3810-9) así como para la lectura de firmas fluorescentes de microalineamientos de ADN (Str y jewski et al Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering (2002) , 4626 (Biomedical Nanotechnology Architectures and Applications) , 201-209) . El uso de fluorescencia de resolución temporal multidimensional para la sustracción del fondo de la invención en el presente documento, nunca se usó en ninguna de estas aplicaciones. En cambio, los autores hicieron todo lo posible por investigar qué matriz de soporte de polímero daba lugar a la menor cantidad de fluorescencia... [Seguir leyendo]

1. Método de adquisición de imágenes de electroforesis en gel mono y bidimensional, caracterizado por excitar un fluorocromo unido a una proteína con un dispositivo de exploración de láser pulsado para proporcionar mediciones mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia para la detección y cuantificación de proteínas a un nivel píxel por píxel y utilizar un ajuste multiexponencial de la curva de decaimiento de fluorescencia para separar la fluorescencia que se origina de la especie de proteína marcada con el fluorocromo de la fluorescencia que se origina de otras fuentes seleccionadas del grupo que consiste en, tales como, la propia matriz de gel, disoluciones o partículas presentes en el gel, o de efectos de dispersión, para la posterior sustracción del fondo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la detección y cuantificación de proteínas comprende la cuantificación de fluorescencia tras una etapa de transferencia.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de exploración de láser pulsado es un láser de diodo alojado internamente dentro de un recinto del dispositivo de exploración sellado.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de exploración de láser pulsado se conecta externamente a través de salidas de cable de fibra óptica para proporcionar una flexibilidad óptima en cuanto a las longitudes de onda de excitación que van a usarse.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el método se realiza con la instrumentación existente mejorada.

6. Método según la reivindicación 1, en el que el método se realiza con un sistema de dispositivo de exploración completamente encerrado.

7. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además utilizar ajuste multiexponencial de la curva de decaimiento de fluorescencia para separar la fluorescencia que se origina de la especie de proteína marcada con el fluorocromo de la fluorescencia que se origina de otras fuentes tales como una membrana de transferencia, para la posterior sustracción del fondo.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende además el uso secuencial de múltiples longitudes de onda de láser para la excitación para facilitar una combinación de fluorescencia de resolución temporal con separación espectral de fluorocromos, usando multiplexación a través de separación espectral para disminuir la complejidad de los espectros de decaimiento de tiempo de vida.

9. Método según la reivindicación 8, en el que hay mediciones dobles mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia.

10. Método según la reivindicación 1, que comprende además integrar una curva de decaimiento fluorescente de la intensidad específica para el fluorocromo para calcular el área bajo la curva.

11. Método según la reivindicación 1, que comprende además incorporar características de automatización y de uso fácil.

12. Método según la reivindicación 11, en el que las características de automatización y de uso fácil incluyen al menos uno de cálculos gráficos y cuantitativos de electroforesis en gel mono o bidimensional adquirida, protocolos automatizados para el análisis de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia, sustracción de las componentes de fondo y exportación de imágenes de intensidad para la (s) componente (s) del fluorocromo para los fluorocromos patrón usados en electroforesis en gel bidimensional.

13. Método según la reivindicación 1, que comprende además maximizar la automatización, facilitar la programación de exploración secuencial de múltiples protocolos diferentes según defina el usuario, incluyendo la exploración secuencial de múltiples fluorocromos usados para multiplexación.

14. Método según la reivindicación 1, que comprende además usar sondas fluorescentes usadas en proteómica basada en gel y diodos láser pulsados de frecuencia variable para la optimización de los tiempos de exploración.