Cultivo mejorado de queratinocitos y su uso.

Un procedimiento para preparar in vitro un equivalente epidérmico o complejo de piel apropiado para eltratamiento posterior de un defecto de la piel,

comprendiendo dicho procedimiento:

a) cultivar un folículo piloso anagénico para obtener células de la vaina externa de la raíz;

b) cultivar dichas células de la vaina externa de la raíz para obtener células precursoras queratinocíticas; y

c) preparar un equivalente epidérmico o complejo de piel que comprenda dichas células precursorasqueratinocíticas;

caracterizado porque dicho folículo piloso está intacto.

Cultivo mejorado de queratinocitos y su uso

Campo de la invención

La invención se refiere al campo del cultivo celular de células fibroblásticas dérmicas y precursoras de queratinocitos humanos. La invención también se refiere al uso de células precursoras de queratinocitos cultivadas en la reparación de defectos de la piel mediante procedimientos de injerto dérmico.

Antecedentes de la invención

La cicatrización de los defectos dérmicos progresa a través de tres fases generales: (i) inflamación, (ii) migración de las células de la herida y mitosis y (iii) producción de matriz extracelular y remodelación. Se cree que la secuencia ordenada de estos sucesos está orquestada por interacciones entre células, factores de crecimiento, y proteínas de la matriz extracelular. Una etapa crucial de la cicatrización de las heridas de la piel es la regeneración epidérmica (es decir, la re-epitelialización) . Además, los queratinocitos epidérmicos interfoliculares de los bordes de la herida, las células de la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos residuales también contribuyen a este proceso (véase, por ejemplo, Eisen y col, 15 J. Invest. Dermatol. 145-155 (1955) . La ORS de los folículos pilosos se compone en su mayor parte de queratinocitos no diferenciados que abarcan las estructuras cilíndricas de la vaina interior endurecida de la raíz y el eje piloso (véase, por ejemplo, Montagna y Parakkal, en: The Structure and Function of Skin 172-258 (Academic Press Nueva York, NY, 1974) ) . Bibliografía reciente también ha indicado que las células ORS se encuentran a un nivel de compromiso más inferior para la diferenciación que los queratinocitos interfoliculares basales (véase, por ejemplo, Coulombe y col., 109 J.Cell Biol. 2295-2312 (1989) ; Limat y col., 194 Exp. Cell Res.218-227 (1991) ; Limat y col., 275 Cell Tissue Res. 169-176 (1994) ) , habiéndose detectado en los animales, así como en la región de la ORS humana, cerca del área sobresaliente, células que conservan el marcaje, que representan posiblemente células madre para los tejidos epiteliales dérmicos (véase, por ejemplo, Cotsarelis y col., 61 Cell 1329-1337 (1990) ; Kobayashi y col., 90 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7391-7395 (1993) ; Yang y col., 105 J. Invest. Dermatol. 14-21 (1993) ; Rochat y col., 76 Cell 1073-1076 (1994) ; Moll, 105 J. Invest. Dermatol 14-21 (1995) . Adicionalmente, las células ORS humanas que se aíslan de los folículos pilosos depilados del cuero cabelludo anagénico pueden desarrollarse ampliamente in vitro (véase, por ejemplo, Weterings y col., 104 Brit. J. Dermatol. 1-5 (1981) ; Limat & Noser, 87 J. Invest. Dermatol, 485-488 (1986) ; Imcke y col., 17 J. Am. Acad. Dermatol. 779-786 (1987) ; Limat y col., 92 J. Invest. Dermatol. 758-762 (1989) . En condiciones de cultivo de inmersión convencionales, las células ORS se asemejan a los queratinocitos epidérmicos interfoliculares tanto por criterios morfológicos como bioquímicos (por ejemplo, perfiles queratínicos (véase, por ejemplo, Stark y col., 35 Differentiation 236-248 (1987) ; Limat y col., 92 J. Invest. Dermatol 758-762 (1989) ; Limat y col., 642 Ann. NY Acad. Sci. 125-147 (1991) . En cocultivos organotípicos con fibroblastos dérmicos humanos (esto es, en condiciones que imitan el entorno epidérmico) , las células ORS desarrollan, con respecto a criterios histológicos, inmunohistológicos, ultraestructurales y bioquímicos, un epitelio estratificado que recuerda a la epidermis regeneradora (véase, por ejemplo, Lenoir y col., 130-Dev. Biol. 610-620 (1988) ; Limat y col., 194 Exp. Cell Res. 218-227 (1991) ; Limat y col., 642 Ann. N.Y. Acad. Sci. 125-147 (1991) . Si dichos cultivos organotípicos se injertan en ratones desnudos, las células ORS forman una neo-epidermis regular que está bajo control homeostático (véase, por ejemplo, Limat y col., 59 Transplantation 10321038 (1995) . Por tanto, las células ORS humanas poseen un interés considerable en aplicaciones clínicas.

En la década anterior, el interés se ha centrado en la utilización de células epiteliales cultivadas para cubrir heridas. En primer lugar, láminas de queratinocitos interfoliculares auotólogos cultivados se injertaron con éxito sobre heridas agudas, principalmente en el tratamiento de quemaduras más grandes de tercer grado (véase, por ejemplo, O’Connor y col., 1 Lancet 75-78 (1981) ; Compton y col., 60 Lab. Invest. 600-612 (1989) , aunque también en el tratamiento de epidermólisis ampollosa (véase, por ejemplo, Carter y col., 17 J. Am. Acad. Dermatol, 246-250 (1987) , piodermitis gangrenosa (véase, por ejemplo, Dean y col., 26 Ann.Plast. Surg. 194-195 (1991) ; Limova y Mauro, 20 J. Dermatol. Oncol. 833-836 (1994) ) , y de las heridas después de la extirpación de lunares congénitos gigantes (véase, por ejemplo, Gallico y col., 84 J. Plast. Reconstr. Surg. 1-9 (1989) o la separación de gemelos siameses (véase, por ejemplo, Higgins y col., 87 J. Royal Soc. Med. 108-109 (1994) ) .

Al contrario que en el tratamiento de dichas heridas agudas, el injerto de heridas crónicas (por ejemplo, úlceras de las piernas) con queratinocitos cultivados, ha sido mucho menos exitoso. Los aloinjertos no dan como resultado un “prendido” permanente (véase, por ejemplo, Fabre, 29 Immunol. Lett. 161-166 (1991) y de este modo, pueden clasificarse como un “apósito biológico muy eficaz aunque costoso” (véase, Phillips y col., 21 J. Am. Acad. Dermatol 191-199 (1989) . Un “prendido” definitivo, importante, reproducible, de queratinocitos autólogos injertados mediante diversas modalidades incluyen: láminas de cultivos queratinocíticos sumergidos que consisten sólo en algunas capas de células no cornificadas (Hetton y col., 14 J.Am. Acad. Dermatol., 399-405 (1986) ; Leigh y Purkis, 11 Clin. Exp. Dermatol, 650-652 (1986) ; Leigh y col., 117 Brit. J. Dermatol.591-597 (1987) ; Harris y col., 18 Clin. Exp. Dermatol 417-420 (1993) , células únicas tripsinizadas unidas a apósitos revestidos con colágeno (Br y sk y col., 25 J.Am. Acad. Dermatol. 238-244 (1991) , o equivalentes dérmicos (Mol y col., 24 J.Am Acad. Dermatol. 77-82 (1991) , aún tienen que documentarse de modo convincente en la bibliografía científica. La misma ausencia de hallazgos cuantitativos se mantiene también para diversos informes respecto al injerto de queratinocitos interfoliculares autólogos, recién aislados (Hunyadi y col., 14 J. Dermatol. Surg. Oncol. 75-78 (1988) ) o células ORS (Moll y col., 46

Hautarzt 548-552 (1995) fijados al lecho de la herida utilizando un adhesivo de fibrina. Sin embargo, debe observarse que las desventajas del suero bovino utilizado durante el cultivo de los queratinocitos puede contribuir a una tasa reducida de “prendido”, debido al hecho de que esto opone resistencia en los queratinocitos (véase, por ejemplo, Johnson y col., 11 J. Bum Care Rehab. 504-509 (1990) ) .

Para producir equivalentes dérmicos, el documento DE-A-19651992 describe el cultivo de células de la vaina exterior de la raíz en suero homólogo o autólogo al 10-15%. Para optimizar la manipulación, los equivalentes dérmicos pueden sembrarse en membranas de ácido hialurónico o en otro material biodegradable antes del trasplante.

Lenoir-Viale, M.C. (Arch. Dermatol. Res. 1993-285: páginas 197-204) describe la preparación in vitro de una epidermis reconstruida a partir de la vaina externa de la raíz de folículos pilosos humanos. La epidermis reconstruida se describe como una herramienta valiosa y prometedora para estudios farmacológicos y puede representar un modelo de cicatrización de las heridas.

Limat A, (J, of Investigative Dermatology 2000, 7 de nov, páginas 128-134) describe el cultivo de folículos pilosos (los bulbos pilosos y las partes infundibulares se eliminan) para generar equivalentes epidérmicos y su utilización para tratar las úlceras crónicas de las piernas.

Limat y Hunziker, Meth. In Mol. Med.: Human Cell Culture Protocols, Totowa, NJ, 1996, páginas 21-31 desvelan un procedimiento que comprende las etapas de depilar folículos pilosos del cuero cabelludo, disociar células ORS del folículo y después colocar las células ORS disociadas en un medio de soporte de crecimiento sobre una capa alimentadora preformada.

Sumario de la invención

Antes de la descripción de la presente invención en el presente documento, la metodología convencional para la generación de un cultivo primario de queratinocitos de ORS consiste en depilar cabello anagénico (es decir, eje piloso en crecimiento) mediante una disección... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar in vitro un equivalente epidérmico o complejo de piel apropiado para el tratamiento posterior de un defecto de la piel, comprendiendo dicho procedimiento:

a) cultivar un folículo piloso anagénico para obtener células de la vaina externa de la raíz; b) cultivar dichas células de la vaina externa de la raíz para obtener células precursoras queratinocíticas; y c) preparar un equivalente epidérmico o complejo de piel que comprenda dichas células precursoras queratinocíticas;

caracterizado porque dicho folículo piloso está intacto.

2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dichas etapas (a y (b) de cultivo se realizan en un medio que contiene suero humano a una concentración inferior al 5 %.

3. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dichas células precursoras queratinocíticas se siembran a una densidad comprendida entre 3 x 104 células/cm2 y 1 x 105 células /cm2.

4. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por seleccionar dichas células precursoras queratinocíticas mediante:

d) cultivo primario de dichas células precursoras queratinocíticas derivadas de la vaina externa de la raíz mediante adhesión de dicho cabello anagénico intacto a una membrana microporosa, llevando dicha membrana, en su superficie inferior, células alimentadoras de crecimiento detenido/limitado para seleccionar células precursoras queratinocíticas a partir de la vaina externa de la raíz del cabello; e) cultivo organotípico de las células de la vaina externa de la raíz recuperadas de dichos cultivos primarios, modulando una membrana microporosa que también posee en su superficie inferior células alimentadoras de crecimiento detenido/limitado; y f) generar, después de esto, dicho equivalente epidérmico o complejo de piel para utilización posterior como un inserto de injerto colocando una membrana transportadora sobre la parte superior de dicho cultivo organotípico de la etapa d) y separando dicho equivalente epidérmico o complejo de piel;

de tal manera que dicho injerto comprende las células precursoras queratinocíticas y una membrana transportadora como una unidad laminar única, sembrándose dichas células precursoras queratinocíticas sobre dicha membrana transportadora a una densidad comprendida entre 3x104 células /cm2 y 1x105 células /cm2.

5. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho equivalente epidérmico o complejo de piel se reviste en su parte superior o en su lado cornificado con una cola de fibrina.

6. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicha cola de fibrina contiene uno o más agentes antimicrobianos, antifúngicos o antivirales emulsionados en la misma.

7. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que dichas células de la vaina externa de la raíz son células homólogas.

8 Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que dicho equivalente epidérmico o complejo de piel comprende células de la vaina externa de la raíz cultivadas en un medio que solo contiene complementos biológicos homólogos o autólogos.

9. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho equivalente epidérmico se reviste en su parte superior o en su lado cornificado con una membrana transportadora.

10. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células de la vaina externa de la raíz son células autólogas obtenidas de un individuo que posteriormente se someterá a tratamiento para un defecto de la piel.

11. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la densidad del cultivo de dichas células alimentadoras de crecimiento detenido/limitado sobre dicha membrana microporosa está comprendida entre aproximadamente 1x104 células /cm2 y aproximadamente 5x104 células /cm2.

12. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dichas células alimentadoras de crecimiento detenido/limitado son células depositadas en un banco o inmortalizadas.

13. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el dicho equivalente epidérmico o complejo de piel comprende células de la vaina externa de la raíz cultivadas en un medio que solo contiene productos de liberación homólogos o autólogos de componentes sanguíneos.

14. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 13, caracterizado porque dicho equivalente epidérmico o complejo de piel comprende células de la vaina externa de la raíz cultivadas en un medio que solo

contiene productos de liberación homólogos o autólogos de componentes sanguíneos a una concentración de aproximadamente 0, 1 % a aproximadamente 20 %.

15. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicha membrana microporosa está

revestida con una o más sustancias de la matriz extracelular seleccionadas entre fibrina, fibronectina, colágenos, 5 lamininas e hialuronano.

16. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicha membrana microporosa posee, en su superficie inferior, un sistema de células alimentadoras de crecimiento detenido/limitado, seleccionándose al menos un tipo de dichas células alimentadoras entre fibroblastos dérmicos humanos, células epidérmicas, células mesenquimales, células neuronales y células endoteliales.

17. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicha membrana transportadora está fabricada con uno o más tipos de materiales seleccionados entre poliéster, PTFE, poliuretano, ácido hialurónico, ácido poliláctico, colágeno y un apósito de gasa de silicona o de vaselina.

18. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que el tamaño de dicho equivalente epidérmico

o complejo de piel se selecciona entre un diámetro de 1, 0 cm, 1, 5 cm, 2, 0 cm y 2, 5 cm.

19. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que adicionalmente comprende el envío o el transporte de dicho equivalente epidérmico o complejo de piel mediante:

g) la separación de dicho equivalente epidérmico o complejo de piel de dicho medio de cultivo, h) la transferencia de dicho equivalente a un transportador y i) la puesta en contacto de dicho equivalente epidérmico y el transportador con un medio solidificado o

gelificado.

20. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 19, en el dicho equivalente está revestida en su parte superior o en su lado cornificado con una membrana transportadora.

21. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 20, en el dicho equivalente se precinta adicionalmente y se envía para emplearlo en el futuro para realizar injertos.

22. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 19, en el que dicho medio solidificado o gelificado se selecciona entre agarosa, metil celulosa y otra sustancia gelificante.