Células dendríticas.

Células dendríticas cargadas con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína antigénica asociada a tumor o fragmento de la misma y al menos una proteína antigénica asociada a tumor o fragmento de la misma,

donde la molécula de ácido nucleico codifica la Transcriptasa Inversa Telomerasa (TERT) y la proteína antigénica asociada a tumor es Survivina y donde dichos fragmentos tienen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de dicha proteína antigénica asociada a tumor.

Células dendríticas La presente invención se refiere a las células dendríticas y su uso.

Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno (APC) derivadas de la médula ósea que juegan un papel fundamental en la inducción y regulación de la respuesta inmune. Se ha descrito que la generación y manipulación in vitro de las DC humanas puede ser particularmente eficaz para estimular el sistema inmunológico contra el cáncer, siendo una nueva y poderosa herramienta en la lucha contra el tumor. De hecho, se ha demostrado que en pacientes que sufren de diferentes tipos de cáncer, tales como, pero exclusivamente tumor de mama, ovario, cabeza y cuello, colorrectal y renal, carcinoma hepatocelular y melanoma maligno, la incapacidad del sistema inmunitario del huésped para combatir eficazmente el establecimiento cáncer está estrictamente relacionada con una función de DC disminuida. Estos cambios se han detectado principalmente en la sangre, en cánceres de células infiltrantes y en ganglios linfáticos (LNS) . Además, se ha documentado que la mayoría de las quimioterapias deterioran profundamente la función de DC, mientras que la capacidad de las células T de los pacientes para producir una respuesta inmune eficaz es comparable con la que se observa en personas sanas. Esta observación implica que la facilidad para el establecimiento del tumor manifestada por el sistema inmune de los pacientes de cáncer se debe principalmente a la presencia de posibles defectos funcionales en las DC como el mantenimiento de un fenotipo inmaduro y/o el equilibrio incorrecto entre la secreción de IL-12 y IL-10. En consecuencia, se ha demostrado que los niveles séricos de IL-10 son significativamente superiores en los pacientes que sufren de cáncer que en los de los controles sanos de edad y sexo similares. Se ha demostrado que IL-10 tiene un efecto inhibidor significativo en varios aspectos de la función de DC, tales como la expresión de moléculas coestimuladoras y la capacidad de sintetizar IL-12. Lo que es mas importante, las DC tratadas con IL-10 se vuelven tolerogénicas. Además, se ha informado de que en los pacientes con tumor de crecimiento progresivo, las DC son inmaduras y están inactivas. Dado que el efecto antitumoral de las DC depende de su nivel de activación y maduración, es probable que el fallo en la inducción de las células T específicas de tumor que producen una respuesta citotóxica dependa del equilibrio incorrecto entre IL-10 e IL-12, así como de la ausencia de los marcadores de maduración, necesarios para obtener la activación esperada de las células T. De hecho, la función inmunosupresora de IL-10 se puede modular mediante una producción simultánea de IL-12. Por ejemplo, se ha demostrado que las DC maduras derivadas de monocitos secretan generalmente tanto IL-12 como IL-10 por estimulación de CD40L. En este caso, la secreción acoplada de IL-10 e IL-12 induce una respuesta inmune más eficaz contra el cáncer que la observada por la secreción única de IL-12. En presencia de niveles de IL-12 moderados-altos, la secreción de IL-10 promueve la activación de las células T colaboradoras (células T CD4+) y, por tanto se desencadena el sistema inmunitario adaptativo.

Uno de los principales objetivos de las estrategias de inmunoterapia actuales es activar eficazmente el sistema inmune del huésped contra el cáncer. Entre ellos, el uso de DC modificadas y cultivadas in vitro y de las células T son los métodos más comunes. Aunque muchos estudios in vitro a pequeña escala, modelos animales, así como ensayos clínicos han demostrado un éxito parcial, especialmente en relación con el desencadenamiento de una respuesta citotóxica fuerte mediada por células T CD8+, todos ellos fracasan al demostrar el establecimiento de una respuesta adaptativa potente, que sea capaz de luchar contra cualquier recidiva tumoral, incluso años después de concluir la terapia.

El enfoque más común en el uso de las DC para vacunas es preparar un gran número de DC mieloides maduras autólogas (MDC) ex vivo, cargarlas con un antígeno (s) específico para el cáncer e inyectarlas de nuevo en el sujeto. Dado que la tasa de diferenciación de monocitos a DC maduras es baja, es importante conseguir una cantidad de precursores de DC compatible con la producción a gran escala de DC maduras. Este objetivo se consigue normalmente, alternativamente, por (1) diferenciación de las DC a partir de monocitos derivados por leucoféresis/elutriación con GM-CSF e IL-4 o con GM-CSF e IL-13 ó (2) aislando DC directamente a partir de los productos de leucoféresis por centrifugación en gradiente de densidad o con los sistemas cerrados disponibles comercialmente, basados en el uso de perlas inmunomagnéticas.

Una vez diferenciadas a partir de los monocitos, las DC inmaduras (iDC) deben cargarse y madurar in vitro. Mientras que la etapa de carga puede realizarse según varios métodos en forma de antígeno de proteína nativa o modificada, ARNm, ADNc, lisado de tumores, etc; la maduración se realiza generalmente por medio de la adición de uno de los combinados siguientes: (a) IL- lº, IL-6, TNF-a, y PGE2; (b) LPS e IFN-y; (c) Ribomunil e IFN-y. Aunque en la técnica se observa que las DC maduradas con un combinado que incluye PGE2 expresan aún CCR7 e inducen Th1 así como respuestas de las células T CD8+, fracasan al secretar IL-12p70 bioactiva detectable, a diferencia de las DC maduradas con LPS / Ribomunil e IFN-y.

En Zhou Y. et al. (J. Immu. Thera. 25 (2002) : 289-303) se describen los métodos para la carga de las células dendríticas con antígenos tumorales. Los autores de esta publicación describen que la carga puede tener lugar con péptidos o proteínas o, alternativamente, con moléculas de ácido nucleico que codifiquen dichos péptidos y proteínas.

En Onaitis M. et. al. (Surg. Oncol. Clin. N. Am. 11 (2002) : 645-660) se dan a conocer varios métodos para la carga de células dendríticas con antígenos.

En la revisión del artículo de Osada T. et al. (Int. Rev. Immunol. 25 (2006) : 377-413) se describen inmunoterapias basadas en células dendríticas. Las células dendríticas utilizadas en estos métodos se pueden cargar con antígenos asociados a tumor.

En Rammensee H-G (Immunol. Cell. Biol. 84 (2006) : 290-294) se describen las ventajas de las células dendríticas cargadas ya sea con péptidos o con moléculas de ARN para vacunas.

En la solicitud de patente internacional WO2006/020889 se describe la carga de células dendríticas con moléculas de RNAm que codifican TERT o fragmentos de la misma.

En Ciesielski M.J. et al. (Cancer Immunmol. Inmunother. 55 (2006) : 1491-1503) se describe un método para producir células dendríticas cargadas con el ADN que codifica Survivina. Estas células son capaces de expresar Survivina en dichas células dendríticas.

En Otto K. et al. (Vaccine 23 (2005) : 884-889) se investiga la utilidad de las células dendríticas cargadas con epítopos de Survivina para la vacunación de tumores.

En Hsu A. K. W. et al. (Biol. Blood Marrow Transplat. 12 (2006) : 855-867) , se describen células dendríticas cargadas con moléculas de ARNm que codifican Survivina.

En Morse M. A. et al. (Cancer Res. 58 (1998) : 2965-2968) se describe la carga de células dendríticas con péptidos que derivan del antígeno CEA asociado un tumor o su ARN codificante.

También en Nair S. K. et al. (Int. J. Cancer 82 (1999) : 121-124) , se describen células dendríticas cargadas con el antígeno CEA asociado a tumor.

En Fuessel S. et al., (Prostate 66 (2006) : 811-821) se describen investigaciones clínicas en las que células dendríticas que se han cargado con PSA, antígeno prostático específico de membrana (PSMA) , Survivina, prosteina y el receptor de potencial transitorio p8 (trp-P8) se administran a 8 pacientes.

Todos estos documentos muestran métodos de carga basados en antígeno de proteína (s) o en antígeno (s) de RNAm /ADNc.

Un objeto de la presente invención es proporcionar células dendríticas que muestren propiedades inmunológicas mejoradas.

Estas DC deberían mostrar preferiblemente (a) una reducción de al menos el 80% de su capacidad fagocítica en comparación con iDC; (b) capacidad para migrar en respuesta a estímulos (que incluyen pero no se limitan a CCL19 y/o CD40L; (c) un fenotipo maduro, es decir elevada expresión en superficie de CD80, CD86, CD40, CD83, HLA-ABC y HLA-DR, (d) niveles de secreción de IL-12 medios o altos con o sin IL-10, (e) expresión en superficie del antígeno... [Seguir leyendo]

1. Células dendríticas cargadas con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína antigénica asociada a tumor o fragmento de la misma y al menos una proteína antigénica asociada a tumor o fragmento de la misma, donde la molécula de ácido nucleico codifica la Transcriptasa Inversa Telomerasa (TERT) y la proteína antigénica asociada a tumor es Survivina y donde dichos fragmentos tienen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de dicha proteína antigénica asociada a tumor.

2. Célula según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es un ácido ribonucleico, preferiblemente ARNm, y/o un ácido desoxirribonucleico.

3. Célula según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína antigénica es un péptido de Survivina.

4. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque las células dendríticas son de origen humano o animal.

5. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque las células dendríticas están maduras.

6. Método de preparación de células dendríticas ex vivo tal y como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde se han proporcionado células dendríticas, que comprende las etapas:

- Cargar dichas células con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno o un fragmento del mismo asociado a tumor y al menos una molécula de proteína que es un antígeno o un fragmento del mismo asociado a tumor, donde la molécula de ácido nucleico es Transcriptasa Inversa Telomerasa y la proteína antigénica es Survivina y donde tales fragmentos tienen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de dicha proteína asociada a tumor.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque las células dendríticas han sido proporcionadas por transdiferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque las células dendríticas inmaduras maduran al cargar o después de la carga así como durante la carga del antígeno de proteína.

9. Preparación farmacéutica que comprende células dendríticas tal y como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Preparación según la reivindicación 9, caracterizada porque la preparación comprende además al menos un excipiente farmacéutico, al menos un agente estimulante de la inmunidad, al menos un coadyuvante.

11. Células dendríticas tal y como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su utilización como vacuna para el tratamiento o prevención de cáncer en los individuos.