Una planta de cebada o porción de la misma que comprende una proteína LOX-1 mutada,

en la que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, en la que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.

Cebada pobre en lipooxigenasa 1

Campo de la invención Esta invención está en el campo de la biotecnología vegetal. Más específicamente, la invención se refiere a un gen de lipooxigenasa 1 (lox-1) de cebada mutante que codifica una enzima con actividad formadora de ácido 9hidroperoxioctadecanoico muy reducida. La invención se refiere también al uso de cultivares de cebada homocigóticos de lox-1 en procesos de fabricación de cerveza para reducir la formación de aromas desagradables en productos de la fabricación de cerveza, tales como cerveza, durante el almacenamiento.

Antecedentes de la invención

Las lipooxigenasas son una familia de enzimas (EC 1.13.11.12) que catalizan la dioxidación de ácidos grasos poliinsaturados libres y esterificados que contienen una configuración 1 (Z) , 4 (Z) -pentadieno. Los productos de las reacciones catalizadas por lipooxigenasa son sospechosos desde hace tiempo de ser los principales culpables de la aparición de aromas rancios en grano/semilla vegetales y en productos alimentarios derivados de grano/semilla (Robinson et al., 1995, Food Chem., 54: 33-43) . Las lipooxigenasas se han implicado en la producción de hexanaldehídos volátiles generados durante el procesamiento de la soja, que tienen un aroma indeseable que limita el uso de proteínas de soja en productos alimentarios. Se cree que tres isozimas de lipooxigenasa expresadas en semilla de soja contribuyen a la oxidación lipídica y la formación de hexanal. Se han generado mutantes de soja que carecen de una o más de estas isozimas con el objetivo de reducir la formación de hexanal y mejorar su estabilidad aromática. El éxito de este enfoque se ha evaluado por Hildebrand et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936.

Los mutantes que carecen de lipooxigenasa de soja 3 producían mayores niveles de hexanal, sugiriendo que esta isozima desvía los 13-hidroxiperoxioctadecanoides producidos por la oxidación lipídica hacia productos no volátiles. El rendimiento de campo de las líneas de soja triples nulas, que carecen de las tres lipooxigenasas de semilla, ha mostrado que estas enzimas no son esenciales para las características agronómicas y de semilla normales (Narvel et al., 1998, Crop Sci. 38: 926-928) .

Las lipooxigenasas se han implicado también en la generación de aromas desagradables en el arroz, que pueden aparecer durante el almacenamiento del grano. Puede detectarse la liberación de ácidos grasos libres en el grano almacenado, que es indicativo del metabolismo de las reservas de triglicéridos. La variedad de arroz Daw Dam se ha encontrado que acumula los menores niveles de pentanales y hexanales, dando una mejor estabilidad aromática en almacenamiento (Susuki et al., 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124) . Este fenotipo deseable se atribuyó a la ausencia de lipooxigenasa 3 de arroz, que oxida las cadenas de acilo lipídicas insaturadas formando isómeros posicionales de ácido 9-hidroxiperoxioctadecanoico.

Se reconoce que la ruta de la lipooxigenasa es compleja, con muchas ramificaciones, y su papel en numerosos aspectos del crecimiento y fisiología vegetal no se entiende completamente. Se han propuesto modificaciones de la ruta de la lipooxigenasa que alteran la actividad de 9-hidroperoxidación en cultivos de semilla para regular su sensibilidad a la contaminación por micotoxina por Aspergillus spp. (documento WO 9726364) , lo que es consistente con la implicación de esta ruta en la resistencia vegetal a patógenos, pero no está relacionado con los objetivos de la invención descrita en la presente memoria.

Entre los muchos productos volátiles aromáticos que contribuyen al aroma de la cerveza, los aldehídos insaturados superiores con una cadena de 6-12 carbonos tienen umbrales de aroma organoléptico particularmente bajos (Meilgaard 1975, MBAA Tech. Quart. 12: 151-168) . El trans-2-nonenal, que es un miembro de este grupo, tiene tanto un umbral de aroma extremadamente bajo de 0, 11 ppb como contribuye a un aroma desagradable similar a la paja "acartonado" en la cerveza. El aroma desagradable característico causado por el trans-2-nonenal es una característica común de las cervezas almacenadas durante 1-3 meses o más y es particularmente perjudicial para el aroma de la cerveza rubia, que se fabrica con maltas ligeras y tiene un aroma delicado.

45 El sulfito se ha conocido desde hace tiempo que mejora la estabilidad aromática de la cerveza, no solo al unirse al oxígeno y actuar como antioxidante, sino también al formar compuestos de adición de bisulfito volátiles con aldehídos y cetonas presentes en la cerveza. Las dos fuentes principales de sulfito en la cerveza son el sulfito producido por la levadura durante la fermentación por la ruta de asimilación de azufre y el sulfito añadido a la cerveza antes del envasado. Las condiciones de fermentación que potencian la producción y secreción de sulfito de 50 levadura permitirán la formación de aductos de sulfito-carbonilo a partir de los carbonilos presentes en el mosto y evitarán su metabolismo posterior por la levadura (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisboa, pág. 209216) . De esta manera, los carbonilos tales como de acetaldehído y diacetilo pueden transferirse a la cerveza. La capacidad del sulfito de evitar la aparición del compuesto carbonílico trans-2-nonenal durante el envejecimiento de la cerveza se ha demostrado fabricando cerveza con una cepa de levadura bloqueada en la ruta de asimilación de 55 azufre (Johannesen et al., 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Niza, pág. 655-662) . Después del embotellado, se sometió la cerveza a envejecimiento forzado por almacenamiento a 37º C durante 7 días, después de lo cual se encontró que los niveles de trans-2-nonenal estaban bastante por encima del umbral de sabor. Si se añadía sulfito 10 ppm a la cerveza pobre en sulfito justo antes del embotellamiento, se reducía significativamente la aparición de trans-2-nonenal durante el envejecimiento forzado. La reacción entre sulfito y compuestos de carbonilo es reversible y está bajo control termodinámico y cinético. Las constantes de equilibrio aparente de los compuestos de bisulfito se encuentran en el intervalo de 10-6 M para los compuestos de carbonilo tales como acetaldehído, hexanal y decanal hasta 10-3 para diacetilo y piruvato (Dufour 1991, supra) . Durante el almacenamiento de la cerveza, el intercambio de gas a través del envasado permitirá la entrada de oxígeno a la cerveza y se perderá el sulfito, de tal modo que los aductos de bisulfito más débiles se disociarán, permitiendo que aparezcan carbonilos libres en la cerveza. Aunque el sulfito potencia incuestionablemente la estabilidad aromática de la cerveza, particularmente a corto plazo, su retención en la cerveza envasada depende en gran medida del intercambio de gas a través del envasado y de la temperatura. En una cerveza acabada, los niveles naturales de sulfito producidos durante la fermentación son variables y la adición de sulfito antes del embotellado no es una práctica universalmente aceptada. Por estas razones, el sulfito solo no proporciona un procedimiento fiable para potenciar la estabilidad aromática a largo plazo de la cerveza en las diferentes condiciones de almacenamiento de cerveza usadas por todo el mundo.

Está generalmente aceptado que el trans-2-nonenal encontrado en la cerveza es el resultado de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados derivados de lípidos de grano de cebada, en que el ácido graso de cadena de 18

carbonos, el ácido linoleico [clasificado como un ácido graso poliinsaturado 18:2, n-6 (Broun, Gettner y Sommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216) ] es el más abundante. Sin embargo, no hay acuerdo en la bibliografía respecto al mecanismo mediante el cual se forma el trans-2-nonenal. Se ha propuesto la presencia de rutas enzimáticas que conducen a la formación de trans-2-nonenal a partir de ácidos grasos poliinsaturados, pero las etapas enzimáticas individuales no se han demostrado experimentalmente nunca en grano de cebada o durante el proceso de malteado (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol. 9: 161-215) . El concepto de uso de tecnología genética anticodificante o de cosupresión para reducir los niveles de lipooxigenasa 1 en grano de cebada, y así controlar la 9hidroperoxidación y reducir los niveles de aldehído y alcohol en el grano de cebada acabado, se ha propuesto como un medio para controlar la formación de aromas desagradables, pero los resultados de dicho enfoque no se han notificado (McElroy y Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245-249) .

Se ha desarrollado una prueba forzada como procedimiento para valorar el potencial... [Seguir leyendo]

1. Una planta de cebada o porción de la misma que comprende una proteína LOX-1 mutada, en la que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, en la que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO:

12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.

2. La planta de cebada o porción de la misma según la reivindicación 1, en la que la actividad LOX-1 comprende la catálisis de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados libres y esterificados y de ácidos grasos octadecanoicos poliinsaturados para formar derivados de ácidos grasos 9-hidroperoxidados.

3. La planta de cebada o porción de la misma según la reivindicación 1, en la que Xaa es ácido glutámico o ácido aspártico.

4. La planta de cebada o porción de la reivindicación 3, en la que Xaa es ácido aspártico.

5. Grano o progenie vegetal que comprende una proteína LOX-1 mutada, en los que la proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID No. 12, en la que Xaa es D, E, H, K, R, T, S,

Y, W, N o Q, producida a partir de la planta de cebada o porción de planta de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una malta o mosto que comprende una proteína LOX-1 mutada, en los que la proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID No. 12, en la que Xaa es D, E, H, K R, T, S, Y, W, N o Q, producida a partir de la planta de cebada o porción de planta de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o a partir del grano o progenie vegetal de la reivindicación 5.

7. Uso de una malta o mosto según la reivindicación 6, para la preparación de una bebida que presenta cualidades organolépticas que permanecen estables durante un periodo de tiempo medido o a temperaturas de almacenamiento elevadas en comparación con una bebida preparada a partir de un producto vegetal de un control no mutado.

8. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de una bebida.

9. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de una malta o cerveza.

10. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una

cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la estabilización de las propiedades organolépticas de un producto de la fabricación de cerveza durante un periodo de tiempo medido, en comparación con un producto de fabricación de la cerveza de control producido usando una planta de cebada no mutada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o producto vegetal.

11. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de un producto de la fabricación de la cerveza que tiene niveles reducidos de trans-2-nonenal libre durante un periodo de tiempo medido o en condiciones de temperatura de almacenamiento elevada, en comparación con un producto de la fabricación de cerveza de control producido usando una planta de cebada no mutada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o producto vegetal.

12. Un proceso para la producción de cerveza a partir de cebada en el que la cebada o una porción de la misma comprende una proteína LOX-1 mutada, en el que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, y en el que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.

13. Un proceso según la reivindicación 12, en el que Xaa es ácido glutámico o ácido aspártico.

45 14. Un proceso según la reivindicación 13, en el que Xaa es ácido aspártico.

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