ANTÍGENO MICOBACTERIANO RECOMBINANTE DE TIPO HEMAGLUTININA DE UNIÓN A LA HEPARINA (HBHA) METILADA.

Péptido recombinante inmunógeno, caracterizado porque es una forma metilada del producto de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un antígeno micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA) a nivel del campo de unión a la heparina de la HBHA de secuencia KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK.

Antígeno micobacteriano recombinante de tipo hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA) metilada. La presente invención se inscribe en el ámbito de la búsqueda y de la puesta a punto de nuevas vacunas para el tratamiento de las infecciones micobacterianas, en particular la tuberculosis. La invención se refiere a una secuencia peptídica recombinante inmunógena metilada, que corresponde a la hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA) identificada en unas cepas micobacterianas tales como Mycobacterium tuberculosis y M. bovis BCG (Menozzi et al. 1996. J. Exp. Med. 184: 993-1001). La invención se refiere asimismo a unos procedimientos de preparación de una secuencia peptídica inmunógena que comprende la HBHA recombinante, siendo dicha secuencia metilada por modificación post-traduccional. La invención se refiere en particular a unos procedimientos de metilación química o enzimática de una secuencia peptídica que comprende la HBHA y previamente producida en una forma recombinante no metilada. La invención se refiere además a unas herramientas, vectores y hospedantes celulares recombinantes, para la realización de los procedimientos químicos o enzimáticos de metilación post-traduccional de la HBHA recombinante. La invención se refiere finalmente a unas composiciones inmunógenas que comprenden la HBHA metilada, nativa o recombinante, siendo dichas composiciones útiles para la preparación de vacunas contra las infecciones micobacterianas. Las micobacterias son unos bacilos cuyo hábitat está muy diversificado. Según las especies, estas bacterias pueden colonizar el suelo, el agua, las plantas, los animales y/o el ser humano. Algunas especies, tales como M. smegmatis, son unos saprófitos no patógenos. Otras especies, sin embargo, son unos patógenos más o menos severos de los animales y/o del ser humano. Así, M. avium provoca unas infecciones en las aves. M. bovis es responsable de la tuberculosis bovina, aunque también ha estado implicado en casos de tuberculosis humana. En el ser humano, la tuberculosis está principalmente causada por la especie altamente patógena M. tuberculosis. En cuanto a la M. leprae, es responsable de la lepra, otra patología del ser humano que hace estragos principalmente en los países en vías de desarrollo. La tuberculosis sigue siendo hoy en día un problema de salud pública preocupante, en la medida en la que representa la primera causa de mortalidad relacionada con un agente infeccioso único. La Organización Mundial de la Salud (OMS) censó 8,8 millones de casos de tuberculosis en 1995 (Dolin et al. 1994. Bull. WHO 72: 213-220). Más recientemente, la OMS ha publicado unas cifras alarmantes, con 10 millones de nuevos casos de tuberculosis por año y una mortalidad que alcanza 3 millones de personas por año (Dye et al. 1999. J. Am. Med. Assoc. 282: 677-686). Se estima que un tercio de la población mundial está infectada por M. tuberculosis. Sin embargo, no todas las personas infectadas desarrollan la enfermedad. El problema planteado por la tuberculosis se agravó en los años 80, con la emergencia y el desarrollo de la pandemia debida al síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Así, el número de casos de tuberculosis asociada a la inmunodepresión provocada por el retrovirus VIH, responsable del SIDA, no dejó de aumentar. Para ser eficaz, el tratamiento médico de la tuberculosis exige generalmente ser prolongado, sobre todo en los pacientes también infectados por el virus VIH. En el pasado, las infecciones con M. tuberculosis eran frenadas eficazmente por ciertos antibióticos, entre los cuales están la rifampicina, la isoniazida y la pirazinamida. Sin embargo, las antibioterapias han mostrado rápidamente sus limitaciones en el tratamiento curativo de la tuberculosis debido, por un lado, a la aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a los antibióticos, en particular a la isoniazida y, por otra parte, a la toxicidad de ciertas moléculas anti-tuberculosas, como la pirazinamida. Una sola vacuna está autorizada y se utiliza habitualmente desde hace más de 75 años para prevenir la infección tuberculosa. Se trata del bacilo de Calmette y Guérin, denominado BCG. Esta vacuna consiste en una forma viva de una cepa de M. bovis, aislada en 1908 en una vaca, y hecha avirulenta in vitro con el fin de permitir su administración por vía parenteral en el ser humano. Sin embargo, esta vacuna está actualmente sujeta a controversia porque presenta limitaciones, en particular, en términos de eficacia. En efecto, según numerosos ensayos clínicos efectuados por todo el mundo, la eficacia de protección obtenida gracias a la vacuna BCG varía de 0 a 85% (Fine, P.E. 1989. Rev. Infect. Dis. 11 Supl. 2: S353-S359). Un meta-análisis sugiere que la eficacia media del BCG no superaría el 50% de protección frente a la tuberculosis pulmonar (Colditz et al. 1994. Jama 271: 698- 702). Además, la vacuna BCG es relativamente eficaz en el niño, mientras que su efecto protector es casi nulo en el adulto. Además, en la medida en que la vacuna BCG consiste en una cepa micobacteriana viva, su administración no está libre de efectos secundarios en el organismo humano, a pesar de que se trate de una cepa atenuada. Como dichos efectos secundarios se manifiestan con más razón en las personas inmunodeprimidas, por lo tanto se debe descartar la vacunación de estos pacientes con el BCG. Este problema no se puede salvar matando y desactivando los BCG puesto que en tal caso, éstos pierden cualquier actividad protectora (Orme, I.M. 1988. Infect. Immun. 56: 3310-3312). 2   La presente invención tiene por lo tanto como objetivo evitar los inconvenientes de la vacuna BCG, proponiendo una nueva composición inmunógena susceptible de ser utilizada como vacuna contra la tuberculosis. Esta composición inmunógena puede asimismo ser utilizada de manera más general en el ámbito de la prevención de las infecciones micobacterianas. La tuberculosis es una enfermedad de contacto, que se transmite por vía aérea. Una vez inhalados, los gérmenes de M. tuberculosis llegan hasta los pulmones, que constituyen el foco infeccioso inicial. A partir de los pulmones, los gérmenes son rápidamente diseminados por vía sanguínea o linfática hacia otras regiones del organismo. La secuencia entera del genoma de la cepa de M. tuberculosis mejor caracterizada hasta la fecha, a saber H37Rv, ha sido determinada y analizada con el fin de profundizar los conocimientos relativos a la biología de este patógeno, e identificar nuevas dianas que permitan implementar nuevos tratamientos terapéuticos, es decir, profilácticos o curativos (Cole et al. 1998. Nature 393: 537-544). Así, el enfoque actual consiste en crear unos bancos genómicos a partir del ADN de M. tuberculosis y en detectar sistemáticamente dichos bancos para identificar nuevas dianas terapéuticas potenciales. Curiosamente, se ha observado que las cepas de M. tuberculosis presentan entre sí una gran homogeneidad genética, siendo los cambios de nucleótidos de una secuencia genómica a otra muy raros. Asimismo, la mayor parte de las proteínas son idénticas a través de todas las cepas de esta especie. Esto resulta particularmente importante a nivel de la inmunidad y del desarrollo de vacunas, en la medida en la que los marcadores antigénicos a determinar son casi ubiquitarios. A pesar de la importante incidencia de las infecciones micobacterianas, se conocen todavía pocas cosas de los mecanismos moleculares primarios implicados en su patogénesis. Uno de los mayores acontecimientos de la patogénesis de la tuberculosis es la adherencia de los microorganismos a las células dianas. Los macrófagos alveolares han sido durante mucho tiempo considerados como la puerta de entrada de M. tuberculosis, y se supone que transportan las bacterias de los pulmones hacia otros organismos. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la M. tuberculosis era asimismo capaz de interactuar con las células epiteliales, entre las cuales están las células M, lo que podría permitir a los bacilos atravesar directamente la barrera epitelial (Teitelbaum et al. 1999. Immunity 10: 641-650). La contribución relativa de cada uno de estos mecanismos, así como los factores bacterianos implicados en la diseminación extra-pulmonar de M. tuberculosis siguen siendo hoy en día desconocidos. Las cepas de M. tuberculosis producen en su superficie una adhesina denominada HBHA por heparin-binding hemagglutinin adhesin (Menozzi et al. 1996. J. Exp. Med. 184: 993-1001). Esta proteína está asimismo producida por otras micobacterias patógenas, tales como M. leprae y M. avium (Reddy et al. 2000. J. Infect. Dis. 181: 1189- 1193). En cambio, la HBHA no está producida por la especie saprófita no patógena M. smegmatis (Pethe et al. 2001. Mol. Microbiol. 39: 89-99). La unión de M. tuberculosis a las células epiteliales se inhibe mediante... [Seguir leyendo]

1. Péptido recombinante inmunógeno, caracterizado porque es una forma metilada del producto de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un antígeno micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA) a nivel del campo de unión a la heparina de la HBHA de secuencia KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK. 2. Péptido recombinante inmunógeno según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la heparina se obtiene a partir de M. bovis BCG o M. tuberculosis. 3. Péptido recombinante inmunógeno según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia nucleotídica codifica para una parte de la proteína HBHA que contiene por lo menos el campo de unión a la heparina de la HBHA. 4. Péptido recombinante inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los grupos metilos son llevados por unos residuos lisinas situados en el campo de unión a la heparina de la HBHA. 5. Péptido recombinante inmunógeno según la reivindicación 4, caracterizado porque los residuos lisinas son mono- o dimetilados. 6. Péptido recombinante inmunógeno según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque los grupos metilos son llevados por la totalidad o parte de los residuos lisinas situados en el campo de unión a la heparina de la HBHA. 7. Péptido recombinante inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque los grupos metilos son llevados por todos los residuos lisinas situados en el campo de unión a la heparina de la HBHA. 8. Procedimiento de obtención de un péptido recombinante inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende por lo menos las etapas siguientes: a) la producción mediante un hospedante celular recombinante, de una proteína HBHA recombinante; b) la purificación de dicha proteína, y c) su metilación post-traduccional; pudiendo el orden de las dos últimas etapas ser inverso. 9. Procedimiento de obtención según la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína HBHA recombinante está constituida por su campo de unión a la heparina. 10. Procedimiento de obtención según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el hospedante celular recombinante es una bacteria. 11. Procedimiento de obtención según la reivindicación 10, caracterizado porque la bacteria es M. smegmatis. 12. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la etapa de metilación se realiza por vía química. 13. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la etapa de metilación se realiza por vía enzimática. 14. Procedimiento de obtención según la reivindicación 13, caracterizado porque la reacción de metilación se cataliza mediante por lo menos una metiltransferasa contenida en los extractos de proteínas totales de micobacterias. 15. Procedimiento de obtención según la reivindicación 14, caracterizado porque la por lo menos una metiltransferasa está contenida en los extractos de proteínas totales de M. bovis BCG o M. smegmatis. 16. Péptidos recombinantes inmunógenos metilados susceptibles de ser obtenidos mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15. 17. Uso de una forma metilada de la HBHA nativa, o de una forma metilada de la HBHA recombinante a nivel del campo de unión a la heparina de secuencia KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK, para la preparación de vacunas contra infecciones micobacterianas. 18. Uso según la reivindicación 17, para la preparación de vacunas contra infecciones por M. bovis o M. tuberculosis. 13   19. Uso según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque la forma recombinante es un péptido recombinante inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 20. Composición inmunógena, caracterizada porque comprende, como principio activo, una forma metilada de la HBHA nativa, o una forma metilada de la HBHA recombinante a nivel del campo de unión a la heparina de secuencia KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente compatible. 21. Composición inmunógena según la reivindicación 20, caracterizada porque la forma metilada está asociada a uno o varios adyuvantes. 22. Composición inmunógena según la reivindicación 20 ó 21, caracterizada porque comprende además unos excipientes farmacéuticamente compatibles, tales como el agua, un tampón salino, dextrosa, glicerol, etanol, o mezclas de los mismos. 23. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizada porque la forma metílica es la HBHA nativa. 24. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizada porque la forma metílica es un péptido recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 25. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, formulada para una administración por vía nasal, oral, subcutánea, intradérmica, intramuscular, vaginal, rectal, ocular o auricular. 26. Composición inmunógena según la reivindicación 25, que comprende unos compuestos auxiliares seleccionados de entre unos agentes humectantes, emulsionantes o tampones. 27. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada porque comprende entre 0,1 y 20 g de proteína HBHA purificada por dosis. 28. Composición inmunógena según la reivindicación 27, caracterizada porque comprende 5 g de proteína HBHA purificada por dosis. 14     16   17   18   19