VIRUS HERPES RECOMBINANTE Y USOS DEL MISMO.

La presente invención se refiere a un virus herpes recombinante que tiene un ADN que codifica el gen gB del virus de la laringotraqueitis infecciosa (al que se alude aquí en lo que sigue como ILTV), y a usos del mismo. Más específicamente, se refiere a un virus herpes recombinante con una secuencia parcial del gen gB de ILTV que puede estar presente de forma estable en el recombinante, y una vacuna contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa. Técnica de antecedentes La laringotraqueitis infecciosa es provocada por la infección de ILTV. ILTV infesta a aves tales como pollos, faisanes, pavos reales y pavos. Rasgos característicos del brote en pollos incluye la aparición de síntomas respiratorios, la elevación de la temperatura corporal y anorexia y similares, tos grave, expectoración y esputos. Cuando se infestan a gallinas ponedoras, la tasa de puesta de huevos comienza a disminuir aproximadamente cuatro días después del brote de la enfermedad, y transcurre aproximadamente un mes antes de que se vuelva a una puesta normal. Además de ello, se han reseñado aumentos en la tasa de mortalidad debido a la infección mixta de ILTV y otros agentes patógenos, y la laringotraqueitis infecciosa infringe enormes pérdidas económicas en la industria de las aves de corral. Para la prevención de la laringotraqueitis infecciosa, se han utilizado convencionalmente vacunas vivas secas o vacunas vivas congeladas procedentes de cepas de vacunas atenuadas. Sin embargo, el efecto de inmunización varía con el entorno de cría, la densidad de cría, el método de inoculación y similares. Además de ello, existen también riesgos de que la vacunación pueda provocar ligeros síntomas en el tracto respiratorio y métodos o cantidades de inoculación deficientes pueden conducir al brote de la enfermedad. En algunas zonas, existen informes de enfermedades provocadas por la patogenicidad invertida de cepas de vacunas y, así, se está buscando el desarrollo de vacunas seguras y eficaces. Con el fin de superar los problemas, se han desarrollado recientemente, mediante la tecnología recombinante, vacunas que comprenden, en calidad de ingrediente activo, un vector de virus recombinante. Con respecto a ILTV, se ha investigado el uso del virus de la viruela aviar (al que se alude aquí en lo que sigue como FPV) en calidad de vector de virus, y está comercialmente disponible en los EE.UU. (BIOMUNE, nombre registrado VECTORMUNE FP- LT (+AE)). ILTV es un virus causante de la laringotraqueitis infecciosa. ILTV es uno de los virus herpes y el genoma del virus consiste en un ADN de doble cadena que comprende aproximadamente 160.000 pares de bases. Se conocen el gen de timidina quinasa (Griffin et al., J. Gen. Virol. 71:841, 1990), el gen gp60 (Kongsuwan et al., Virus Genes 7: 297- 303, 1993), el gen p40 de la cápsida (Griffin et al., Nucleic Acids Res. 18:366, 1990), el gen de glicoproteína B (gB) (Poulsen et al., Virus Genes 5: 335 347, 1991; Griffin et al., J. Gen. Virol. 72: 393-398, 1991; patente de EE.UU. nº 5.443.831), el gen de glicoproteína C (gC) (Kingsley et al., Virology 203: 336-343, 1994), el gen RR2 (Griffin et al., J. of General. Virol. 70: 3085-3089, 1989), el gen UL32 (publicación de patente internacional WO 98/07866) y similares. El marco de lectura abierto del gen gB de ILTV tiene una longitud total de 2613 pb (873 aminoácidos), y está reseñado en la patente de EE.UU. nº 5.443.831, etc. que un FPV recombinante que tiene el gen de longitud completa integrado en él exhibe un efecto en forma de vacuna. Los virus de la viruela tales como FPV se desarrollan rápidamente en el hospedante y, después de expresar la proteína del antígeno, son expelidos por completo del sistema inmune del hospedante. Sin embargo, dado que la inmunidad se memoriza y se refuerza después de expeler el virus, el virus de la viruela es adecuado para uso como hospedante para la vacuna. Por otra parte, los virus herpes tales como el virus herpes de los pavos (al que se alude aquí en lo que sigue como HVT) no se desarrollan rápidamente en el hospedante, y la infección latente dura mucho tiempo. Durante esta latencia, los virus herpes continúan estimulando el sistema inmune del hospedante. Se está investigando el uso de HVT recombinante en calidad de un vector del virus utilizando una característica de este tipo. A pesar de que la publicación nacional japonesa PCT nº 4-501658 (documento EP 434721) describía que se ha construido un HVT recombinante que comprende HVT en el que se ha insertado un gen de antígeno de ILTV, de hecho el HVT recombinante no ha sido construido. 2   Además, en la publicación de patente japonesa no examinada nº 2001-000188 se ha construido un HVT recombinante en el que se han insertado dos genes, es decir, un gen gB de longitud completa de ILTV y un gen UL32. Se ha confirmado que este HVT recombinante expresa in vitro una proteína que corresponde al gen insertado utilizando un método de ensayo inmunofluorescente, pero no se ha confirmado un efecto en calidad de una vacuna. Descripción de la invención Bajo las circunstancias de la tecnología convencional, los autores de la presente invención han intentado purificar, mediante subcultivo, un virus herpes recombinante, en el que en el genoma del virus herpes se ha insertado una molécula de ADN en la que se ligó un promotor situado más arriba del gen gB de longitud completa de ILTV. Sin embargo, la purificación era imposible debido a la deleción del gen gB de ILTV. Cuando se produce la deleción del gen gB, el virus herpes recombinante no actúa como una vacuna anti-ILTV. Además de ello, ILTV y HVT son ambos virus herpes, y HVT per se tiene al gen gB como un gen esencial. Así, dado que genes gB pueden competir uno con otro en el momento de formar partículas de virus, los autores de la presente invención pensaron que sería importante evitar una compleción y conservar la antigenicidad suprimiendo la porción de anclaje a la membrana y el dominio citoplásmico del producto de gen gB de ILTV con el fin de cambiar la proteína gB de ILTV de una proteína de la membrana a una proteína secretora. Basados en esta idea, tras un estudio intenso y amplio con el fin de obtener virus herpes recombinantes que fuesen estables durante el subcultivo, los autores de la presente invención han encontrado que se puede obtener un efecto de vacuna acortando el gen gB hasta una longitud predeterminada, además de suprimiendo la porción de anclaje a la membrana y el dominio citoplásmico, y se puede obtener un mayor efecto de vacuna ligando el gen gB acortado a una secuencia aditiva específica y, por lo tanto, han completado la presente invención. Así, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un virus herpes recombinante, excluido el virus de la laringotraqueitis infecciosa, que tiene un ADN que codifica un polipéptido que comprende 429 aminoácidos en el extremo amino terminal de una proteína codificada por el gen gB del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) o un polipéptido en el que un aminoácido ha sido suprimido, añadido o sustituido en dicho polipéptido. Además de ello, se proporciona una vacuna contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa que comprende, en calidad de ingrediente activo, a dicho virus herpes recombinante. Breve explicación de los dibujos La Fig. 1 es un dibujo que compara FW050 con el vector de homología original. La Fig. 2 es un diagrama esquemático del vector de homología. Mejor modo para llevar a cabo la invención. La presente invención se explicará ahora con detalle en lo que sigue. ADN El ADN para uso en la presente invención es uno (al que se alude aquí en lo que sigue como el gen gB parcial) que codifica un péptido parcial que comprende 429 aminoácidos en el extremo amino terminal de una proteína (a la que se alude aquí en lo que sigue como la proteína gB) codificada por el gen gB de ILTV. La secuencia de aminoácidos de este péptido parcial puede incluir la deleción, adición o sustitución de uno o una pluralidad de aminoácidos. Como un ejemplo específico de ADN para uso en la presente invención se puede mencionar un ADN que codifica una secuencia de 429 aminoácidos recogida en SEQ ID NO: 2, y como un ejemplo específico se puede mencionar un ADN de una secuencia de nucleótidos recogida en SEQ ID NO: 3. Como ILTV que puede ser un origen del gen gB se puede mencionar, por ejemplo, la cepa NS-175 (la cepa número VA0204 del Catálogo de Cultivos para la Higiene Animal, the Japanese Association of Veterinary Biologics), la cepa CE (Kouda, Azabu Veterinary College Research Report, 31, 133-202, 1976), la cepa SA-2 (Johnson et al., Arch. Virol., 119, 181-198, 1991), la cepa de aislado de campo 632 muy tóxica (Keeler et al., Avian Diseases, 35, 920-929, 1991), y la cepa de enfrentamiento USDA (Poulsen et al., J. General. Virol., 78, 2945-2951, 1997). El gen gB no está específicamente... [Seguir leyendo]

1.- Un virus herpes recombinante, excluyendo el virus de la laringotraqueitis infecciosa, que tiene un ADN que codifica un polipéptido parcial que consiste en 429 aminoácidos en el extremo amino terminal de la proteína gB codificada por el gen gB de un virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), en el que puede estar suprimido, añadido o sustituido un aminoácido del polipéptido parcial. 2.- El virus herpes recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, excluyendo el virus de la laringotraqueitis infecciosa, en el que puede estar suprimido, añadido o sustituido un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID Nº: 4, está enlazada en un marco con el extremo 3 del ADN que codifica un polipéptido parcial que consiste en 429 aminoácidos en el extremo amino terminal de la proteína gB codificada por el gen gB de un virus de la laringotraqueitis infecciosa, en el que puede estar suprimido, añadido o sustituido un aminoácido del polipéptido parcial. 3.- El virus herpes recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en donde el virus herpes es un virus herpes que infesta aves. 4.- El virus herpes recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en el que un virus herpes es un virus tipo 1, 2 ó 3 de la enfermedad de Marek. 5.- Una vacuna contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa, que comprende en calidad de ingrediente activo un virus herpes recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 6.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, para tratar virus herpes en un ave. 7.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el virus herpes es el virus de la laringotraqueitis. 23   24