UN PRODUCTO DE DETECCIÓN DE PROTEASA.

La presente invención se refiere a un producto de detección de proteasa que es adecuado para detectar una enzima proteasa en una muestra. Las proteasas son enzimas que digieren proteínas, en particular hidrolizando y escindiendo enlaces peptídicos. De este modo una proteína que se degrada por una proteasa se escinde en dos o más péptidos más pequeños. La escisión de un péptido se produce cuando las proteasas hidrolizan un enlace peptídico que está adyacente a una serie específica de restos aminoacídicos, aunque otras proteasas son menos específicas y requieren solamente uno o dos aminoácidos para dirigir la actividad de escisión peptídica. Un área de desarrollo completamente separada ha sido la de inmunoensayos de flujo lateral. Estos inmunoensayos permiten la detección de analitos en muestras. Un ejemplo habitual de un inmunoensayo tal es un kit de ensayo de embarazo, que comprende una tira de nitrocelulosa en la que se localizan, de un extremo al otro: un área receptora de muestra absorbente; una banda de anticuerpo marcado; una banda de anticuerpo de captura y una banda de control. La banda de anticuerpo marcado comprende una pluralidad de anticuerpos monoclonales, específicos para hCG (gonadotropina coriónica humana) y conjugados con partículas de oro. Los anticuerpos marcados son móviles en, y fluyen a través de, la tira de nitrocelulosa en presencia de un líquido. La banda de anticuerpo de captura comprende una pluralidad de anticuerpos monoclonales inmovilizados, cada uno específico para hCG (aunque un epítopo diferente de la misma que los anticuerpos marcados). La banda de control comprende una pluralidad de anticuerpos inmovilizados específicos para inmunoglobulina G (IgG) de una especie particular. Para usar el kit para ensayar con respecto a embarazo a un individuo, se deposita una muestra (típicamente orina) del individuo en la zona receptora de la muestra. La muestra fluye de forma natural (siguiendo la fuerza capilar) a lo largo de la extensión de la tira hacia en primer lugar la banda de anticuerpo marcado, después la banda de anticuerpo de captura y finalmente la banda de control. Debe apreciarse que la tira proporciona de este modo una ruta de flujo líquido para la muestra. A medida que los contenidos de la muestra pasan por la banda de anticuerpos marcados, el anticuerpo marcado se moviliza dentro de la tira y también se transporta en la dirección de la banda de anticuerpo de captura. Si hCG está presente en la muestra entonces el anticuerpo marcado se une a la hCG. Cuando el anticuerpo marcado alcanza la banda de anticuerpo de captura, puede suceder una de dos cosas. Si está presente hCG en la muestra entonces la hCG se une a los anticuerpos de captura. La mayoría de la hCG ya se habrá unido a los anticuerpos marcados y por lo tanto se forma un complejo en el anticuerpo de captura inmovilizado, formando la hCG un enlace o puente entre el anticuerpo de captura y el anticuerpo marcado. Esto se denomina habitualmente un sándwich de anticuerpo. Como alternativa, si no hay hCG en la muestra entonces el anticuerpo marcado pasa a través de la banda de anticuerpo de captura sin interaccionar con los anticuerpos de captura. Debe apreciarse que los anticuerpos de captura se inmovilizan y por lo tanto en ninguno de los casos fluyen a lo largo de la tira. Posteriormente, la muestra alcanza la banda de control. Debido a que hay un exceso de anticuerpo marcado en el kit, incluso si hCG está presente en la muestra, hay suficiente anticuerpo marcado presente en el kit para asegurar que algo de material pasa más allá de la banda de anticuerpo de captura. De este modo, si hCG está presente o no en la muestra, algo de anticuerpo marcado alcanza la banda de control. En la banda de control, el anticuerpo anti- IgG inmovilizado se une a, y por lo tanto inmoviliza, el anticuerpo marcado. Debe entenderse que cuando el anticuerpo se inmoviliza y concentra, la presencia de las partículas de oro forma una línea visible. Por lo tanto, si hCG está presente en la muestra (que será el caso si el individuo está embarazado) entonces se forma una línea visible en la banda de anticuerpo de captura. Independientemente de si hCG está presente o no en la muestra, se formará una línea visible en la banda de control. La línea en la banda de control es útil porque es indicativa de que el ensayo ha alcanzado su conclusión (que puede no suceder si, por ejemplo, hay insuficiente líquido en la muestra) y confirma que el dispositivo ha funcionado correctamente. También permite una comparación de la banda de anticuerpo de la banda de anticuerpo de captura con la banda de control para proporcionar certeza adicional al resultado. La presente invención proporciona un producto mejorado para detectar la presencia de enzimas proteasa. De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un producto de detección de proteasa para detectar una enzima proteasa en una muestra que comprende: un medio que proporciona una ruta de flujo líquido; un componente escindible preinmovilizado en la ruta de flujo líquido en una primera localización, 2 E07732335 25-10-2011   comprendiendo el componente escindible un elemento base conectado a un elemento liberable mediante un péptido enlazador sensible a proteasa, comprendiendo el elemento liberable una estructura de unión a marcador e inmovilizándose el elemento base dentro de la estructura del medio mediante una unión entre el elemento base y una estructura en la ruta de flujo líquido; un marcador capaz de unirse a la estructura de unión a marcador; un componente de captura localizado corriente abajo de la primera localización en la ruta de flujo líquido, siendo capaz el componente de captura de unirse al elemento liberable. El componente escindible puede estar unido al marcador (por ejemplo de forma covalente) en cuyo caso el componente escindible puede considerarse un componente marcado. Como alternativa, el componente escindible puede ser un componente separado del marcador, por ejemplo, el marcador puede comprender un anticuerpo para la estructura de unión al marcador en el elemento liberable del componente escindible. El componente escindible se preinmoviliza en la ruta de flujo líquido, en cuyo caso la primera localización es la posición en la ruta de flujo líquido en la que se localiza el componente escindible. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un producto de detección de proteasa para detectar una enzima proteasa en una muestra que comprende: un medio que proporciona una ruta de flujo líquido; un componente marcado preinmovilizado en la ruta de flujo líquido, comprendiendo el componente escindible un elemento base conectado a la liberación de un elemento mediante un enlace sensible a proteasa de péptido, comprendiendo el elemento liberable un marcador e inmovilizándose el elemento base dentro de la estructura del medio mediante una unión entre el elemento base y una estructura en la ruta de flujo líquido; un componente de captura localizado corriente abajo del componente marcador en la ruta de flujo líquido, siendo capaz el componente de captura de unirse al elemento liberable. Preferiblemente, el medio que proporciona la ruta de flujo líquido es una tira absorbente, por ejemplo, una compuesta de nitrocelulosa. De manera práctica, el medio de inmovilización comprende una unión entre elemento base y una estructura en la ruta de flujo líquido. Por ejemplo el elemento base puede comprender biotina y la estructura en la ruta de flujo líquido es estreptavidina. De manera práctica, el producto de detección de proteasa comprende adicionalmente un inhibidor de proteasa localizado corriente arriba del componente de captura o componentes de captura en la ruta de flujo líquido. Preferiblemente, el producto de detección de proteasa comprende adicionalmente una barrera degradable o rompible en la ruta de flujo líquido. La barrera puede ser de entre 10 y 100 m de grosor. Por ejemplo, en algunas realizaciones la barrera es una barrera soluble tal como colágeno, pectina o PVA. De manera práctica, la barrera degradable o rompible comprende un borde, que se extiende hacia fuera de la ruta de flujo líquido, para evitar que el material pase alrededor de la barrera cuando pasa a lo largo de la ruta de flujo líquido. El borde puede extenderse hacia fuera al menos 0,5 mm. Generalmente el borde se extiende hacia fuera menos de 5 mm, preferentemente menos de 2 mm. Se prefiere más un borde de aproximadamente 1 mm. Provechosamente, el producto de detección de proteasa comprende adicionalmente una zona receptora de muestras para la mezcla del componente escindible y la muestra, en la que la primera localización está dentro de la zona receptora de muestras y en la que la barrera degradable o rompible se localiza corriente abajo de la zona receptora de muestras y corriente arriba del componente... [Seguir leyendo]

1. Un producto de detección de proteasa para detectar una enzima proteasa en una muestra que comprende: un medio que proporciona una ruta de flujo líquido; un componente escindible preinmovilizado en la ruta de flujo líquido en una primera localización, comprendiendo el componente escindible un elemento base conectado a un elemento liberable mediante un péptido enlazador sensible a proteasa, comprendiendo el elemento liberable una estructura de unión a marcador y estando inmovilizado el elemento base dentro de la estructura del medio mediante una unión entre el elemento base y una estructura en la ruta de flujo líquido; un marcador capaz de unirse a la estructura de unión a marcador; y un componente de captura localizado corriente abajo de la primera localización en la ruta de flujo líquido, siendo capaz el componente de captura de unirse al elemento liberable. 2. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un inhibidor de proteasa localizado corriente arriba del componente de captura en la ruta de flujo líquido. 3. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente una barrera degradable o rompible en la ruta de flujo líquido. 4. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la barrera degradable o rompible comprende un borde, que se extiende hacia fuera de la ruta de flujo líquido, para evitar que el material pase alrededor de la barrera degradable o rompible cuando pasa a lo largo de la ruta de flujo líquido. 5. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 que comprende adicionalmente una zona receptora de muestras para la mezcla del componente escindible y la muestra, en el que la primera localización está dentro de la zona receptora de muestras y en el que la barrera degradable o rompible está localizada corriente abajo de la zona receptora de muestras y corriente arriba del componente de captura. 6. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el componente de captura comprende la mitad de un par de unión. 7. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el componente de captura comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. 8. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el componente de captura comprende celulosa, comprendiendo adicionalmente el elemento liberable un resto de unión capaz de unirse a celulosa. 9. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el resto de unión es galactomanano o xiloglucano. 10. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el componente de captura comprende biotina o estreptavidina. 11. Un producto de detección de proteasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el marcador es una partícula de oro o un grupo fluoróforo. 12. Un método para detectar una enzima proteasa en una muestra usando un producto de detección de proteasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las etapas de: proporcionar la muestra en el extremo corriente arriba de la ruta de flujo líquido y permitir que la muestra pase a lo largo de la ruta de flujo líquido; y determinar la presencia del marcador en el componente de captura y/o en la primera localización. 13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende adicionalmente la etapa de añadir de forma separada el marcador al extremo corriente arriba de la ruta de flujo líquido y permitir que pase a lo largo de la ruta de flujo líquido. 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 que comprende adicionalmente la etapa de aplicar un tampón de lavado al extremo corriente arriba de la ruta de flujo líquido después de la etapa de aplicar la muestra a la ruta de flujo líquido. 11 E07732335 25-10-2011   12 E07732335 25-10-2011   13 E07732335 25-10-2011   14 E07732335 25-10-2011