Proteína de fusión caracterizada por el hecho de que las secuencias de aminoácidos de los diferentes alérgenos Parj1 y Parj2,

pertenecientes a la familia de las proteínas de transferencia de lípidos no específicas (ns-LTPs) de la especie Parietaria judaica, por el hecho de que dichas secuencias no presentan uno o más de los cuatro puentes disulfuro presentes en la secuencia de los alérgenos de tipo salvaje, encontrándose comprendido por lo menos uno en la región aminoterminal ente los residuos aminoácidos 1 y 30, y por el hecho de que dichas secuencias mantienen esencialmente la misma longitud que las secuencias de los alérgenos de tipo salvaje

Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-LTPs, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden.

Campo de la invención

La presente invención se encuentra comprendida dentro de los campos de la prevención y el tratamiento de los síntomas alérgicos asociados a alérgenos pertenecientes a la familia de las proteínas de transferencia de lípidos no específicas (ns-LTPs).

Estado de la técnica

Las proteínas ns-LTPs son moléculas proteicas pequeñas, de aproximadamente 10 kDa, que demuestran una elevada estabilidad y se encuentran naturalmente presentes en todos los organismos vegetales estudiados hasta hoy. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de transportar lípidos a través de las membranas in vitro.

En varias especies también han sido identificadas como alérgenos, tal como en el caso de las rosáceas prunoideas (melocotón, albaricoque, ciruela) y las pomoideas (manzana), así como en urticáceas como la Parietaria. El género Parietaria incluye 5 especies, siendo P. judaica la más alergénica.

La reacción alérgica, también denominada hipersensibilidad de tipo I, es inducida por una respuesta mediada por IgE frente a antígenos ambientales, habitualmente inocuos y presentes, por ejemplo, en granos de polen. La interacción IgE/alérgenos es el suceso inicial de una cascada de reacciones que conduce a la liberación de mediadores, como la histamina, responsables de la sintomatología alérgica. En el caso de que se localicen a nivel de la piel, la liberación de histamina provoca picor, eritema y edema, mientras que, en el caso de que sea generalizada, provoca broncoconstricción a nivel broncopulmonar y fenómenos importantes que implican el sistema cardiovascular.

Las enfermedades alérgicas más comunes son la rinitis, la conjuntivitis, la urticaria, el angioedema, el eccema, la dermatitides, el asma y, en casos extremos, el choque anafiláctico.

La tecnología del ADN recombinante ha permitido aislar diversos alérgenos de la familia de las ns-LTPs, entre ellos los alérgenos principales de Parietaria, denominados Parj1 y Parj2 (Colombo P. et al., The allergens of Parietaria, Int. Arch. Allergy Immunol. 130(3):173-9, 2003, revisión).

Parj1 es una proteína de 176 aminoácidos y un peso molecular de 18.450 kDa. La secuencia N-terminal muestra una composición de aminoácidos característica de secuencias de señal de las proteínas glucosiladas. La proteína madura está compuesta de 139 aminoácidos, con un peso molecular de 14.726 kDa. Es un alérgeno importante, debido a que se une a más de 90% de los sueros de sujetos alérgicos a Parietaria judaica (Costa et al., cDNA cloning, expression and primary structure of Parj1, a major allergen of Parietaria judaica pollen, FEBS Lett. 341(2-3):182-6, 21 de marzo de 1994).

Parj2 es una proteína de 133 aminoácidos y contiene un péptido de señal de 31 aminoácidos. La proteína madura está compuesta de 102 aminoácidos, con un peso molecular de 11.344 kDa. Muestra una homología de 45% con Parj1 a nivel de los aminoácidos y también es un alérgeno importante, debido a que reacciona con la práctica totalidad de los sueros de los sujetos alérgicos (Duro G. et al., cDNA cloning, sequence analysis and allergological characterization of Parj2.0101, a new major allergen of the Parietaria judaica pollen, FEBS Lett. 399(3):295-8, 1996).

A pesar de su homología estructural, Parj1 y Parj2 son, sin embargo, alérgenos independientes que contienen epítopos que también son independientes, tal como han subrayado los experimentos de inhibición cruzada. En el caso de que un grupo de sueros procedentes de sujetos alérgicos se preincube con los alérgenos Parj1 y Parj2 recombinantes, la unión de IgE a la región de 10-14 kDa resulta totalmente inhibida, sugiriendo que únicamente estos dos alérgenos se encuentran presentes en esta región y que conjuntamente son capaces de inhibir la mayoría de las IgE específicas contra los alérgenos de Parietaria judaica (Tabla en fig. 8).

Los alérgenos Parj1 y Parj2 muestran todas las características de las ns-LTPs y el modelo estructural de Parj1 se determinó utilizando el cristal de la ns-LTP de la semilla de soja como referencia. Según dicho modelo, ambas moléculas presentan 4 puentes disulfuro, en el orden 4-52, 14-29, 30-75 y 50-91. Todas las proteínas ns-LTP consideradas, en el caso de que se encuentren convenientemente alineadas tal como se ilustra en la fig. 2 de la solicitud de patente WO nº A-02/20790, contienen cuatro puentes disulfuro entre los residuos cisteína en las posiciones correspondientes a las posiciones anteriormente indicadas de Parj1 o de Parj2.

Mediante la aplicación de una estrategia de mutagénesis específica de sitio, anteriormente se había demostrado la relevancia de los puentes disulfuro para la formación de los epítopos de IgE (patente WO nº A-02/20790) y la existencia de un epítopo dominante en la región bucle1 comprendida entre los aminoácidos 1 y 30 (Colombo P. et al., Identification of an immunodominant IgE epitope of the Parietaria judaica major allergen, J. Immunol. 160(6):2780-5, 1998).

Desde un punto de vista terapéutico, existen diversos tratamientos farmacológicos de la sintomatología alérgica, mientras que la terapia preventiva únicamente se encuentra representada por la inmunoterapia específica (SIT). Esta terapia prevé la administración subcutánea de cantidades diluidas de alérgeno en el paciente, de manera que se suprime la reacción específica hacia el alérgeno. Sin embargo, la mayor parte de los extractos de proteínas comerciales utilizados para ello son, de todas maneras, extractos crudos, mezclas de varios componentes en los que resulta difícil una estandarización precisa del componente alergénico. De esta manera, la estrategia SIT puede comprender la administración de componentes alergénicos para los que no es sensible el paciente, induciendo la producción de IgEs específica contra otros componentes del extracto. Además, la administración del alérgeno total implica un riesgo de efectos secundarios, que incluso podrían provocar un choque anafiláctico. Con el fin de eliminar algunas de las desventajas indicadas en la presente memoria, se han desarrollado moléculas alternativas con efectos secundarios reducidos, es decir, capaces de no interactuar con las IgE, manteniendo simultáneamente la capacidad de inmunosuprimir la respuesta de células T y la capacidad de estimular la producción de inmunoglobulinas IgG.

El trabajo anterior de los presentes autores, dado a conocer en la solicitud de patente WO nº A-02/20790, se encuentra comprendido dentro del mismo alcance. Mediante manipulación genética se produjeron formas variantes, o muteínas, de alérgenos ns-LTP, caracterizados por la eliminación parcial o total de los puentes disulfuro típicos de la proteína nativa. Estas muteínas presentaban una actividad alergénica reducida con características que las convertían en útiles en la SIT como moléculas que sustituyen a las proteínas nativas.

Un enfoque diferente es el descrito por B. Linhart en la solicitud de patente EP nº A-1 219 301. En este caso, se describen polipéptidos híbridos que contienen por lo menos dos proteínas alergénicas de tipo salvaje o fragmentos de las mismas. En alérgenos Phl-p de polen de Phlenum pratense o en alérgenos parásitos Der, Linhart observó una alergenicidad reducida de los péptidos híbridos.

Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de nuevas herramientas que resulten útiles para el tratamiento de formas alérgicas específicas, tales como aquéllas causadas por las proteínas ns-LTPs; herramientas que aúnen las características de alergenicidad reducida con la efectividad inmunoterapéutica elevada y la fácil accesibilidad con respecto a tanto su preparación como a su utilización. El alcance de la presente invención es satisfacer esta necesidad.

Descripción resumida de la invención

Los estudios epidemiológicos han demostrado que los sujetos generalmente alérgicos a diversas plantas pertenecientes al mismo género, o a la misma especie, o incluso a una única variedad vegetal específica, en la mayoría de casos presentan IgEs contra una pluralidad de alérgenos producidos por la planta. Por ejemplo, en el caso de los sujetos alérgicos a Parietaria judaica, habitualmente...

1. Proteína de fusión caracterizada por el hecho de que las secuencias de aminoácidos de los diferentes alérgenos Parj1 y Parj2, pertenecientes a la familia de las proteínas de transferencia de lípidos no específicas (ns-LTPs) de la especie Parietaria judaica, por el hecho de que dichas secuencias no presentan uno o más de los cuatro puentes disulfuro presentes en la secuencia de los alérgenos de tipo salvaje, encontrándose comprendido por lo menos uno en la región aminoterminal ente los residuos aminoácidos 1 y 30, y por el hecho de que dichas secuencias mantienen esencialmente la misma longitud que las secuencias de los alérgenos de tipo salvaje.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la secuencia de aminoácidos de cada uno de los alérgenos se muta independientemente mediante eliminación o sustitución de uno o más residuos cisteína implicados en la formación de un puente disulfuro.

3. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por el hecho de que la secuencia de aminoácidos de cada uno de los alérgenos se muta independientemente mediante eliminación o sustitución de uno o más residuos cisteína en posiciones correspondientes a las posiciones 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91 de la secuencia de aminoácidos del alérgeno Parj1 y/o Parj2.

4. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por el hecho de que contiene las secuencias de aminoácidos de los alérgenos Parj1 y Parj2, ambos modificados independientemente mediante sustitución de los residuos cisteína por los residuos Asn, Ser, Thr, Ile, Met, Gly, Ala, Val, Gln o Leu en las posiciones 29 y 30 ó 4, 29 y 30 ó 29, 30, 50 y 52.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 4, que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4.

6. Secuencia de nucleótidos que comprende el ADN codificante de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 3.

8. Sistema de expresión o clonación que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 ó 7 flanqueado por secuencias adecuadas para controlar, estimular y regular la expresión.

9. Célula huésped transformada por medio del sistema de expresión o clonación según la reivindicación 8.

10. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la utilización en el método diagnóstico o de tratamiento terapéutico in vivo y/o in vitro.

11. Proteína de fusión según la reivindicación 10, para la utilización como agente inmunológico hipoalergénico en el tratamiento de inmunoterapia específica (SIT) de alergias.

12. Proteína de fusión según la reivindicación 10, para la utilización en el tratamiento de rinitis, conjuntivitis, urticaria, angioedema, eccema, dermatitides, asma y choque anafiláctico.

13. Proteína de fusión según la reivindicación 10, para la preparación de vacunas de ADN.

14. Composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, en forma de solución, suspensión, emulsión, crema, pomada o implante.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, para una administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica u oral, o para el implante subcutáneo.

17. Método de preparación de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que se producen secuencias de aminoácidos convenientemente mutados de diferentes alérgenos y se unen directamente o mediante una molécula conectora para la síntesis química o mediante expresión, en forma de proteína de fusión, en células huésped genéticamente modificadas.

18. Método de preparación según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que se transforman células huésped con un vector de expresión que comprende el ADN codificante de secuencias de aminoácidos en forma fusionada, se mutan mediante mutagénesis específica de sitio en codones codificantes de residuos cisteína.

19. Método de preparación según la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que se sustituyen uno o más residuos cisteína por residuos Asn, Ser, Thr, Ile, Met, Gly, Ala, Val, Gln o Leu.

20. Método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado por el hecho de que se sustituye uno o más residuos cisteínas en posición 29, 30 ó 4, 29, 30 ó 29, 30, 50 y 52, por residuos alanina o serina.

21. Método de preparación de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por el hecho de que la proteína heterodímero se mezcla en una cantidad inmunológicamente activa con un excipiente farmacéuticamente aceptable.