La presente invención se refiere a un método para la determinación simultánea automatizada de las vitaminas,

liposolubles y metabolitos de las vitaminas D3 y D2 en suero, caracterizado porque se requiere un volumen adecuado de suero, que se trata en línea mediante un sistema automático de extracción en fase sólida para eliminar las especies interferentes y concentrar las vitaminas, una separación de las vitaminas en un cromatógrafo de líquidos y una medida de cada una de las especies separadas mediante un espectrofotómetro. Los datos que proporciona este detector se interpolan en las rectas de calibrado de las vitaminas previamente obtenidas e introducidas en el programa de cuantificación. Los análisis se pueden solapar (desarrollo de la etapa de extracción en fase sólida de una muestra mientras la anterior se cromatografía), consiguiéndose así una alta frecuencia de muestreo

Procedimiento automatizado para la determinación simultánea de vitaminas liposolubles.

La presente invención se encuadra en el campo técnico de los métodos analíticos para la determinación de vitaminas liposolubles y metabolitos de las vitaminas D₃ y D₂ en suero.

Más concretamente la presente invención consiste en un nuevo método automático para la determinación de las vitaminas liposolubles basado en el acoplamiento de un sistema de extracción en fase sólida con un cromatógrafo de líquidos.

Estado de la técnica anterior a la invención

Existen pocos métodos para la determinación simultánea de vitaminas liposolubles en fluidos biológicos, la mayoría de los cuales consisten en una etapa de extracción líquido-líquido previa a una separación cromatográfica con detección mediante absorción molecular en la zona UV, o mediante espectrometría de masas (MS). Todos ellos son métodos relativamente complejos, largos y caros, especialmente los dedicados a vitamina D por su inestabilidad frente a la temperatura y la luz. Por tanto, resulta de gran interés, tanto en el campo clínico como en metabolómica, el desarrollo de un método que permita determinar en una única muestra y con un tratamiento simple y automático el contenido de vitaminas liposolubles.

Existen tres patentes que reflejan el estado de la técnica anterior a este método y que se comentan brevemente.

La patente española con número ES 2133133B1 se refiere a un método para la determinación de vitamina D3 y sus metabolitos y se basa en las siguientes etapas: una extracción líquido-líquido manual, etapa de limpieza y preconcentración del extracto de suero humano mediante extracción sólido-líquido, separación del extracto mediante HPLC y detección mediante espectrofotometría UV-visible.

La patente que aquí se presenta tiene las siguientes características diferenciales:

En primer lugar sólo se determinan hidroximetabolitos de la vitamina D3, mientras que en el documento que se analiza se determinan en general vitaminas liposolubles y metabolitos de la D2 y D3 y en dicha patente se requiere una etapa de extracción líquido-líquido manual, que no se realiza en el método que se pretende patentar. El procedimiento propuesto se puede usar para cualquier tipo de suero, mientras que en esta patente sólo se hace referencia a suero humano. Además en dicha patente se utilizan 2 mL de suero humano y en el procedimiento expuesto se utilizan entre 0.3 y 1 mL de suero de cualquier especie animal.

La patente KR20030073428 se refiere a un método para la determinación de vitamina E en suero, que se lleva a cabo utilizando HPLC y espectrofotometría UV. No existe etapa de extracción líquido-sólido y, además, sólo determina vitamina E.

La patente americana US 005532166A se refiere a un método rápido de determinación de retinol (vitamina A) en suero mediante electroforesis capilar. Por tanto, la técnica de separación es diferente a la propuesta en la patente que se solicita y, además, sólo se lleva a cabo la determinación de una vitamina.

Quedan, por tanto, de manifiesto aspectos diferenciales que justifican la solicitud de patente para el método propuesto de determinación de vitaminas liposolubles y metabolitos de las vitaminas D2 y D3.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento se refiere a un método para la determinación simultánea de las vitaminas liposolubles D3, D2, A, alfa- y delta-tocoferol, 25-OH-D₃ y 25-OH-D₂ en suero basado en el acoplamiento de un sistema de extracción en fase sólida y un cromatógrafo de líquidos con un detector ultravioleta.

Preparación de la muestra

La sangre y otros fluidos biológicos se recogen en un tubo apropiado, y se realiza el proceso normal de extracción con la muestra.

Desarrollo del método

En un vial de muestra se mezcla un volumen de suero adecuado con un volumen igual de acetonitrilo-agua en relación 6:4 que tiene una concentración 150 milimolar en dodecil sulfato sódico (en adelante SDS). El vial se coloca en un vórtex agitando hasta conseguir una buena mezcla y a continuación en la bandeja del automuestreador para su análisis automático.

Se realiza la inyección automática del contenido del vial en el sistema de extracción líquido-sólido, que sigue la secuencia de operaciones que se describe a continuación. Básicamente, el análisis comienza con la preparación del cartucho de extracción en fase sólida mediante activación de la fase sólida que contiene metanol. acondicionamiento y equilibración con acetonitrilo-agua en relación 3:7 que tiene una concentración 15 milimolar en SDS. A continuación, con esta misma mezcla se arrastra la muestra del bucle de inyección y en estas condiciones los analitos quedan retenidos en la fase sólida. Posteriormente, se introduce una mezcla acetonitrilo-agua en relación 3:7 como disolución de limpieza. En este momento comienza la etapa cromatográfica mediante la elución de los analitos retenidos en la fase sólida por la fase móvil. El cartucho de extracción en fase sólida es un cartucho empaquetado con el sorbente C8 de fase reversa.

La fase móvil inicial es acetonitrilo:metanol en relación 8.5:1.5 a un caudal de 1 mL/min. En el minuto 5 comienza un gradiente lineal hasta el minuto 9 para aumentar el caudal el 50% del caudal inicial. La columna cromatográfica se mantiene a temperatura ambiente. La etapa de extracción se produce simultáneamente con la etapa cromatográfica de la muestra anterior, lo cual reduce considerablemente el tiempo de análisis que hasta ahora se manejaba para este tipo de determinaciones. La columna analítica está rellena con el sorbente C18.

Para la detección se utiliza un detector (UV) en el que se selecciona una longitud de onda para cada clase de compuestos.

Modo de realización de la invención

En un vial de 1.8 mililitros se mezclan 0.5 mL de suero con la misma cantidad de acetonitrilo-agua en relación 6:4 que tiene una concentración 150 milimolar en SDS. El vial se coloca en un vórtex durante 1 minuto para conseguir una buena mezcla y a continuación en la bandeja del automuestreador para su análisis automático.

Se realiza la inyección automática del contenido del vial en el sistema de extracción líquido-sólido. El análisis comienza con la preparación del cartucho de extracción en fase sólida mediante activación de la fase sólida que contiene con 3 mL de metanol, acondicionamiento (3 mL) y equilibración (1 mL) con acetonitrilo-agua en relación 3:7 que tiene una concentración 15 milimolar en SDS. A continuación, con esta misma mezcla se arrastra la muestra del bucle de inyección y bajo estas condiciones los analitos son retenidos en el cartucho de C8. Posteriormente, se introducen 2 mL de una mezcla acetonitrilo-agua en relación 3:7 como disolución de limpieza. En este momento comienza la etapa cromatográfica mediante la elución de los analitos retenidos en la fase sólida por la fase móvil inicial que se produce con el giro de una válvula de seis vías.

La fase móvil inicial es acetonitrilo:metanol en relación 8.5:1.5 a un caudal de 1 mL/min. En el minuto 5 comienza un gradiente lineal hasta el minuto 9 para aumentar el caudal hasta 1.5 mL/min. La columna cromatográfica se mantiene a temperatura ambiente. Con este gradiente se produce la separación en función de su polaridad relativa llegando al detector donde se monitorizan cada uno a su longitud de onda de máxima absorción. También se puede ver el resultado en forma de cromatograma (absorbancia frente a tiempo).

1. Procedimiento automatizado para la determinación simultánea de vitaminas liposolubles y metabolitos de las mismas en suero, caracterizado por comprender las siguientes etapas: