NUEVO SISTEMA HÍBRIDO PARA BRASSICA NAPUS.

Un método para producir o multiplicar semilla de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf,

comprendiendo dicho método las etapas de a) proporcionar una planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf, en el que dicha planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina es i. homocigota para el gen de esterilidad masculina (alelo Ms) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y ii. homocigota para el alelo mantenedor (alelo rf) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y iii. predominantemente estéril masculina cuando se expone antes y/o durante la floración a una temperatura menor que 28ºC, y iv. revierte a un fenotipo predominantemente fértil masculino cuando se expone antes y/o durante la floración a una temperatura mayor que 35ºC, en el que dicho genotipo MsMsrfrf es obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, b) exponer dicha planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina durante al menos 4 horas a una temperatura mayor que 35ºC, y c) exponer la planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina tratada térmicamente obtenida en la etapa (b) a una temperatura menor que 33ºC hasta el desarrollo de flores fértiles masculinas, y d) permitir la autopolinización de las plantas de Brassica napus que tienen dichas flores fértiles masculinas obtenidas en la etapa (c), dejar que se desarrollen las semillas, y cosechar las semillas, en el que las semillas cosechadas se caracterizan porque son semillas de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un sistema de esterilidad masculina condicional nuclear en Brassica napus. Realizaciones de la presente invención proporcionan métodos para la producción 5 de la línea femenina (estéril masculina) prebásica (MsMsrfrf), la línea mantenedora (fértil masculina) (msmsrfrf), la línea femenina (estéril masculina) básica (Msmsrfrf), y líneas híbridas. Realizaciones adicionales de la presente invención se refieren a marcadores asociados con los alelos de esterilidad, de fertilidad y mantenedores, respectivamente, y al uso de esos marcadores para proporcionar el sistema híbrido. 10

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La cosecha que sirve para la producción de aceite a partir de plantas de Brassica es una cosecha cada vez más importante. Como fuente de aceite vegetal, actualmente figura sólo detrás de habas de soja y palma en importancia comercial, y es comparable a girasoles. El aceite se usa tanto como aceite de ensaladas como aceite para cocinar, y desempeña un papel cada vez más importante 15 en biocombustibles (biodiésel).

En su forma original, el aceite de Brassica, conocido como aceite de colza, era nocivo para los seres humanos debido a su nivel relativamente elevado de ácido erúcico. El ácido erúcico está presente habitualmente en variedades de cultivo nativas en concentraciones de 30-50% en peso basado en el contenido total de ácido graso. Este problema se resolvió cuando los científicos de las 20 plantas identificaron un germoplasma con bajo contenido de ácido erúcico (Stefansson, 1983). Aunque estas variedades con menos de 2% de ácido erúcico en su perfil de ácido graso total (calidad cero individual) produjeron aceite comestible, la presencia continuada de compuestos de azufre, denominados glucosinolatos (GSL), en la harina con contenido proteico elevado, siguió siendo un obstáculo importante para la expansión posterior en el mercado. La amplia aceptación de harina de 25 colza para la nutrición animal está impedida por la presencia de los GSL en la semilla. Además, los glucosinolatos también son indeseables puesto que pueden conducir a la producción de productos de ruptura antinutricionales (por ejemplo, tiocianatos, isotiocianato y nitrito) con la escisión enzimática durante la extracción del aceite y digestión cuando son atacados por la enzima endógena mirosinasa durante la trituración. En consecuencia, se desarrollaron las denominadas variedades “doblemente 30 bajas” (bajas en ácido erúcico en el aceite, así como bajas en glucosinolatos en la harina sólida tras la extracción del aceite), que tienen un contenido de ácido erúcico menor que 2% en peso basado en el contenido total de ácido graso, y un contenido de glucosinolatos menor que 30 moles/gramo de la harina libre de aceite. Estas formas de alta calidad de la colza, desarrolladas por primera vez en Canadá, son conocidas como cánola. Actualmente, el umbral máximo establecido por la ley europea 35 es 25 moles de glucosinolato (GSL) total por gramo (g) de semilla a una humedad de 8,5%, según se mide mediante HPLC (decreto de la UE 2294/92). Las variedades de cánola de primavera doblemente bajas, cultivadas en Canadá, necesitan tener niveles de GSL menores que 30 moles de GSL por gramo de harina libre de aceite secada al aire a una humedad de 0%, según se mide mediante TMS. Los niveles de GSL de las variedades de colza doble cero cultivadas habitualmente en Europa y 40 Canadá varían significativamente por debajo de los niveles umbral a 60% del nivel umbral oficial o incluso inferior. Sin embargo, muchos países están solicitando niveles incluso más bajos de glucosinolatos a fin de registrar variedades de cánola.

Además, los científicos de plantas han intentado mejorar el perfil de ácidos grasos para el aceite de colza (Röbbelen, 1984; Ratledge et al., 1984; Röbbelen, 1975; Rakow y McGregor, 1973). 45

Especialmente, la colza de invierno (Brassica napus L. ssp. oleifera (Metzg.), Brassicaceae) es una cosecha importante para la producción de semilla para la obtención de aceite en regiones agrícolas templadas. En Alemania, en el 2006, aproximadamente 1,5 millones de hectáreas (12% del área agrícola total) se sembraron con colza.

La colza es una cosecha predominantemente autopolinizada, con alrededor de un tercio de 50 exogamia (Becker et al., 1992). La reproducción de plantas de colza se ha centrado en semillas polinizadas de forma abierta aprovechando la elevada afinidad por la autocompatibilidad de dichas plantas. La heterosis significativa para el rendimiento de las semillas en colza ha creado interés en el desarrollo de variedades de cultivo híbridas (Riaz et al., 2001). La heterosis significa la ventaja de crecimiento y rendimiento de híbridos en comparación con sus progenitores obtenida mediante el 55 cruzamiento de dos genotipos homocigotos genéticamente diferentes (Shull, 1922). Los híbridos de

colza muestran siempre una heterosis significativa en el rendimiento. Diversos autores han dado a conocer una considerable heterosis para el rendimiento de las semillas en híbridos F1 de colza (Brassica napus L.) al comienzo de la reproducción híbrida en colza (Schuster, 1969; Röbbelen, 1985; Grant y Beversdorf, 1985; Lefort-Buson et al., 1987; Brandle y McVetty, 1989; Paulmann y Frauen, 1991; Stefansson, 1983; Brandle y McVetty, 1990; Shen, 2005). Principalmente, el nivel de heterosis 5 en colza de tipo primavera puede ser tan elevado como 20% a 30%, y en colza de tipo invierno alrededor de 30% a 40%.

Una producción eficaz de semillas híbridas requiere tanto la identificación de grupos heteróticos (patrimonios genéticos distintos; Melchinger y Gumber, 1998, Becker y Link, 2000) como un método para el cruzamiento seleccionado de esos grupos heteróticos. 10

En colza de invierno, las primeras variedades híbridas que se registraron en Europa son asociaciones de líneas híbridas que usan el sistema INRA Ogura e híbridos completamente restaurados usando el sistema MSL (véase más abajo para detalles). Sin embargo, en comparación con líneas consanguíneas de élite, el efecto de la heterosis es todavía moderado. Sin embargo, la ganancia de rendimiento relativamente baja no está provocada por la ineficacia del sistema híbrido, 15 sino por la falta de acervos genéticos diversos en colza como consecuencia de décadas de consanguinidad y regulaciones gubernamentales (por ejemplo, contenido de glucosinolatos o de ácido erúcico), que todavía provocan una variabilidad del germoplasma limitada.

Acervos genéticos más diversos conducirán a mayores efectos heteróticos, pero su desarrollo se inició sólo recientemente. No obstante, un sistema híbrido comercialmente funcional es 20 el requisito previo predominante para lograr incrementos significativos de rendimiento en el futuro en la colza. Esos incrementos no sólo se necesitan por el incremento de demanda para fines alimentarios, sino por la demanda que crece rápidamente de biocombustibles (biodiésel).

Además de la esterilidad masculina inducida químicamente (CHA), se han explorado tres principios de sistemas híbridos a base de genética en variedades de Brassica: los reproductores usan 25 plantas de Brassica autocompatibles (SI), estériles masculinas citoplásmicas (CMS), y estériles masculinas nucleares (NMS; antiguamente también esterilidad masculina genética, GMS) como el progenitor femenino (para un repaso de sistemas híbridos en vegetales, véase Kumar et al., 2004). Las plantas SI no son capaces de autopolinizarse debido a su constitución genética, y las plantas femeninas CMS así como NMS son incapaces de producir polen. De este modo, todas estas plantas 30 se deben de polinizar de forma cruzada mediante un progenitor fértil masculino. Usando estas plantas, los reproductores están intentando mejorar la eficiencia de la producción de semillas y la calidad de los híbridos F1 y reducir los costes de la reproducción. Cuando la hibridación se realiza sin usar plantas SI, CMS o NMS, es más difícil obtener y aislar los rasgos deseados en la progenie (generación F1), debido a que los progenitores son capaces de sufrir tanto polinización cruzada como 35 autopolinización.

Un sistema de control de la polinización simple y eficaz es la etapa clave para utilizar heterosis en la producción de semillas híbridas comerciales. Si uno de los progenitores es una planta SI, CMS o NMS que no es capaz de autopolinizarse, o es incapaz de producir polen, sólo se producirá la polinización cruzada. Eliminando el polen de una variedad parental en un cruzamiento,... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir o multiplicar semilla de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf, comprendiendo dicho método las etapas de

a) proporcionar una planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el 5 genotipo MsMsrfrf, en el que dicha planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina es

i. homocigota para el gen de esterilidad masculina (alelo Ms) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y

ii. homocigota para el alelo mantenedor (alelo rf) obtenible a partir de la semilla de 10 Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y

iii. predominantemente estéril masculina cuando se expone antes y/o durante la floración a una temperatura menor que 28ºC, y

iv. revierte a un fenotipo predominantemente fértil masculino cuando se expone antes y/o durante la floración a una temperatura mayor que 35ºC, 15

en el que dicho genotipo MsMsrfrf es obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480,

b) exponer dicha planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina durante al menos 4 horas a una temperatura mayor que 35ºC, y

c) exponer la planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina tratada 20 térmicamente obtenida en la etapa (b) a una temperatura menor que 33ºC hasta el desarrollo de flores fértiles masculinas, y

d) permitir la autopolinización de las plantas de Brassica napus que tienen dichas flores fértiles masculinas obtenidas en la etapa (c), dejar que se desarrollen las semillas, y cosechar las semillas, 25

en el que las semillas cosechadas se caracterizan porque son semillas de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf.

2. Un método para producir semilla de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo Msmsrfrf, comprendiendo dicho método las etapas de

a) proporcionar como una planta femenina una línea de Brassica napus condicionalmente 30 estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf usando el método según la reivindicación 1, para obtener semillas de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf y haciendo crecer dichas plantas a partir de dichas semillas, en el que dicha planta de Brassica napus femenina condicionalmente estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf es 35

i. homocigota para el alelo de esterilidad masculina (Ms) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y

ii. homocigota para el alelo mantenedor (alelo rf) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 ó 41481, y

iii. predominantemente estéril masculina a una temperatura menor que 28ºC, y 40

iv. revierte a un fenotipo fértil masculino a una temperatura mayor que 35ºC,

v. obtenible de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y

b) proporcionar como una planta masculina una planta de Brassica napus fértil masculina con el genotipo msmsrfrf, en el que dicha planta de Brassica napus con el genotipo msmsrfrf es 45

i. homocigota para el alelo de fertilidad (alelo ms) obtenible de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41481, y

ii. homocigota para el alelo mantenedor (alelo rf) obtenible de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 ó 41481, y

iii. predominantemente fértil masculina, y

iv. obtenible de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41481, y 5

c) permitir que la planta masculina de la etapa b) polinice a la planta femenina de la etapa a), dejar que se desarrolle la semilla, y cosechar la semilla, en el que las semillas cosechadas se caracterizan porque son semillas de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo Msmsrfrf.

3. El método para producir o multiplicar semilla de una línea de Brassica napus 10 condicionalmente estéril masculina con el genotipo Msmsrfrf según la reivindicación 2, en el que dicha línea de planta masculina y dicha línea de planta femenina se proporcionan mediante introgresión del alelo Ms, ms, y/o rf en una línea de Brassica napus consanguínea, seguido de al menos un retrocruzamiento frente a dicha línea de Brassica napus consanguínea.

4. Un método para producir semilla híbrida fértil masculina de Brassica napus, 15 comprendiendo dicho método las etapas de

a) proporcionar como una planta femenina una planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo Msmsrfrf o MsMsrfrf usando el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para obtener semillas de una línea de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el genotipo Msmsrfrf o MsMsrfrf y haciendo crecer 20 dichas plantas a partir de dichas semillas, en el que dicha planta de Brassica napus femenina condicionalmente estéril masculina es

i. heterocigota u homocigota para el alelo de esterilidad masculina (alelo Ms) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y 25

ii. homocigota para el alelo mantenedor (alelo rf) obtenible a partir de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 ó 41481, y

iii. predominantemente estéril masculina a una temperatura menor que 28ºC, y

iv. revierte a un fenotipo predominantemente fértil masculino a una temperatura mayor que 35ºC, y 30

b) proporcionar como una planta masculina una planta de Brassica napus fértil masculina con el genotipo RfRf, en el que dicha planta de Brassica napus fértil masculina es

i. homocigota para el alelo restaurador funcional (alelo Rf), que es obtenible a partir de cualquier línea de Brassica napus fértil consanguínea comercializada como semilla para crecimiento, y 35

ii. predominantemente fértil masculina, y

c) permitir a la planta masculina de la etapa b) polinizar la planta femenina condicionalmente estéril masculina de la etapa a), dejar que se desarrolle la semilla, y cosechar dicha semilla híbrida fértil.

5. El método para producir semilla híbrida fértil masculina de Brassica napus según la 40 reivindicación 4, en el que dicha línea de planta masculina (fértil masculina) y dicha línea de planta femenina (estéril masculina) se basan en antecedentes genéticamente diversos, y/o en el que dicha línea femenina (estéril masculina) es heterocigota para el alelo Ms.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que las plantas femenina (estéril masculina) y masculina (fértil masculina) se hacen crecer en tiras alternas, y/o en el 45 que la floración de las plantas masculinas se retrasa podando o mediante tratamiento con productos químicos que retrasan el crecimiento o sembrando las plantas masculinas (fértiles masculinas) hasta 3 semanas más tarde que las plantas femeninas (estériles masculinas).

7. Un método para la producción de semilla híbrida de Brassica napus que produce plantas

de Brassica napus que producen grano, opcionalmente con un contenido total de glucosinolatos de no más de 25 moles por gramo de semilla secada al aire a 9% de humedad, en el que dicho método comprende uno o más de los métodos según se reivindican en

a) la reivindicación 1, y

b) una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, y 5

c) una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el alelo Ms se caracteriza por conferir un fenotipo condicionalmente estéril masculino nuclear, que

a) se restaura temporalmente a la fertilidad mediante una exposición a una temperatura mayor que 35ºC, 10

b) se restaura a la fertilidad en al menos parte de las plantas F1 obtenidas cruzando una planta estéril masculina con el genotipo MsMsrfrf o Msmsrfrf con cualquier planta de Brassica napus que comprende al menos un alelo Rf dominante, y

c) se mantiene en las plantas F1 obtenidas cruzando una planta con un fenotipo condicional estéril masculino referido por dicho alelo Ms con las plantas fértiles masculinas derivadas de la 15 semilla depositada con el Número de Depósito NCIMB 41481.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el alelo Ms es el alelo Ms presente en la semilla depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 o una variante genética del mismo, que confiere un fenotipo condicionalmente estéril masculino.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el fenotipo 20 condicionalmente estéril masculino y/o el alelo Ms está ligado a y/o asociado con una o más características seleccionadas del grupo que consiste en

I. un fenotipo de aborto de la yema en una planta con un fenotipo estéril masculino conferido por el alelo Ms,

II. un fenotipo de pétalos de rayas blancas o manchados de blanco en una planta con un 25 fenotipo estéril masculino conferido por el alelo Ms, y

III. la presencia de un marcador específico del alelo Ms tanto en plantas fértiles masculinas como estériles masculinas que comprenden al menos una copia del alelo Ms.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el fenotipo condicionalmente estéril masculino y/o el alelo Ms está ligado a y/o asociado con uno o más 30 marcadores seleccionados del grupo que consiste en

I. los marcadores seleccionados del grupo de polimorfismos en la región del marcador NR1116 que consiste en

a) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 85 en SEC ID NO: 3, 35

b) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una G en la posición que corresponde a la posición 87 en SEC ID NO: 3,

c) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 139 en SEC ID NO: 3,

d) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que 40 corresponde a la posición 214 en SEC ID NO: 3,

e) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una G en la posición que corresponde a la posición 218 en SEC ID NO: 3,

f) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una G en la posición que corresponde a la posición 277 en SEC ID NO: 3, 45

g) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que

corresponde a la posición 286 en SEC ID NO: 3,

h) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 312 en SEC ID NO: 3,

i) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 319 en SEC ID NO: 3, 5

j) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 359 en SEC ID NO: 3,

k) la mutación de supresión 5'-TTGGTGAACAATC-3' en la posición correspondiente a 221 en SEC ID NO: 3, y

l) la mutación de inserción 5'-GAA-3' en la posición que corresponde a 328-330 en SEC ID 10 NO: 3,

II. los marcadores seleccionados del grupo de polimorfismos en la región del marcador NR2525 que consiste en

a) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 60 en SEC ID NO: 6, 15

b) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 92 en SEC ID NO: 6,

c) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 105 en SEC ID NO: 6,

d) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que 20 corresponde a la posición 158 en SEC ID NO: 6,

e) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 431 en SEC ID NO: 6,

f) la mutación de supresión de un solo nucleótido en la posición que corresponde a la posición 82 en SEC ID NO: 6, y 25

g) la mutación de supresión 5'-TGAGCAAAA-3' en la posición que corresponde a 17 a 25 en SEC ID NO: 6,

III. los marcadores seleccionados del grupo de marcadores de SNP que consiste en

a) una señal positiva en un ensayo de SNP que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 12, y una señal negativa que usa una 30 sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 11, y

b) una señal positiva en un ensayo de SNP que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 17, y una señal negativa que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 18,

IV. los marcadores seleccionados del grupo de marcadores de SSR que consiste en: 35

a) un fragmento de PCR con un peso molecular aparente de 96,7 (+/- 1,0) pb que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como SEC ID NO: 1 y 2, y

b) un fragmento de PCR con un peso molecular aparente de 192,8 (+/- 0,3) pb que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como 40 SEC ID NO: 4 y 5, y

V. los marcadores seleccionados del grupo de marcadores ligados a al menos una de las secuencias expuestas como SEC ID NO: 3, 6, 11 y 18,

en los que el uno o más marcadores (marcador del alelo Ms) también incluyen una secuencia nucleotídica aislada seleccionada del grupo que consiste en secuencias las cuales 45

I. tienen una identidad de secuencia de al menos 80% con, o

II. se hibridan en condiciones restrictivas con, o

III. comprenden al menos 25 nucleótidos consecutivos de

las secuencias marcadoras definidas anteriormente en las secciones I. a V.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el alelo ms se 5 caracteriza por las propiedades fenotípicas de

a) no ser capaz de revertir a la fertilidad al fenotipo estéril masculino conferido por el alelo Ms, y

b) no ser capaz de conferir un fenotipo estéril masculino en ausencia de un alelo Ms.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 12, en el que el alelo ms está ligado a y/o asociado con uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en 10

I. los marcadores seleccionados del grupo de polimorfismos en la región del marcador NR1116 que consiste en

a) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una G en la posición que corresponde a la posición 85 en SEC ID NO: 3,

b) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que 15 corresponde a la posición 87en SEC ID NO: 3,

c) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 139 en SEC ID NO: 3,

d) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 214 en SEC ID NO: 3, 20

e) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 218 en SEC ID NO: 3,

f) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 277 en SEC ID NO: 3,

g) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una G en la posición que 25 corresponde a la posición 286 en SEC ID NO: 3,

h) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 312 en SEC ID NO: 3,

i) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 319 en SEC ID NO: 3, 30

j) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que corresponde a la posición 359 en SEC ID NO: 3,

k) la mutación de inserción 5'-TTGGTGAACAATC-3' en la posición correspondiente a 221 en SEC ID NO: 3,

l) la mutación de supresión 5'-GAA-3' en la posición que corresponde a 328-330 en SEC ID 35 NO: 3,

II. los marcadores seleccionados del grupo de polimorfismos en la región del marcador NR2525 que consiste en

a) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 60 en SEC ID NO: 6, 40

b) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 92 en SEC ID NO: 6,

c) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 105 en SEC ID NO: 6,

d) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una A en la posición que corresponde a la posición 158 en SEC ID NO: 6,

e) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una C en la posición que corresponde a la posición 431 en SEC ID NO: 6,

f) el marcador de polimorfismo de un solo nucleótido que tiene una T en la posición que 5 corresponde a la posición 82 en SEC ID NO: 6,

g) la mutación de inserción 5'-TGAGCAAAA-3' en la posición que corresponde a 17 a 25 en SEC ID NO: 6,

III. los marcadores seleccionados del grupo de marcadores de SNP que consiste en

a) una señal positiva en un ensayo de SNP que usa una sonda de SNP que comprende la 10 secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 11, y una señal negativa que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 12, y

b) una señal positiva en un ensayo de SNP que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 18, y una señal negativa que usa una sonda de SNP que comprende la secuencia nucleotídica descrita por SEC ID NO: 17, 15

IV. los marcadores seleccionados del grupo de marcadores de SSR que consiste en:

a) un fragmento de PCR con un peso molecular aparente seleccionado del grupo de pesos moleculares aparentes que consiste en 94 (+/- 0,9) pb, 110,4 (+/- 0,5) pb, 112,3 (+/- 0,4) pb y 116,3 (+/- 0,4) pb, que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como SEC ID NO: 1 y 2, y 20

b) un fragmento de PCR con un peso molecular aparente de 183,8 (+/- 0,4) pb o un fragmento de PCR asociado a un alelo no fértil que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como SEC ID NO: 4 y 5,

en los que el uno o más marcadores también incluyen una secuencia nucleotídica aislada seleccionada del grupo que consiste en secuencias las cuales 25

a) tienen una identidad de secuencia de al menos 80% con, o

b) se hibridan en condiciones restrictivas con, o

c) comprenden al menos 25 nucleótidos consecutivos de las secuencias marcadoras definidas anteriormente en las secciones I. a IV.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el alelo rf se 30 caracteriza por las propiedades fenotípicas de

a) no ser capaz de revertir a la fertilidad al fenotipo estéril masculino conferido por el alelo Ms, y

b) ser capaz de mantener un fenotipo estéril masculino conferido por el alelo Ms.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 14, en el que el alelo rf se selecciona del grupo que consiste en 35

a) el alelo rf obtenible de la semilla de Brassica napus depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 ó 41481, y

b) sus variantes, que están en una forma homocigota capaz de mantener el fenotipo de esterilidad masculina conferido por el alelo Ms.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 14 y 15, en el que el alelo rf 40 está ligado a y/o asociado con los marcadores de SSR que consisten en un fragmento de PCR con un peso molecular aparente de 240,8 (+/- 0,4) pb que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como SEC ID NO: 19 y 20.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el fenotipo restaurador de la fertilidad y/o el alelo Rf está ligado a y/o asociado con una o más características 45 seleccionadas del grupo que consiste en

a) restaurar la fertilidad en las plantas F1 obtenidas cruzándolas con la planta de Brassica napus que se hizo crecer a partir de la semilla depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480, y

b) restaurar la fertilidad en las plantas F1 obtenidas cruzándolas con la planta de Brassica napus que se hizo crecer a partir de la semilla obtenida a partir del cruce de la planta de 5 Brassica napus obtenida de la semilla depositada con el Número de Depósito NCIMB 41480 como planta estéril masculina femenina y la planta de Brassica napus obtenida a partir de la semilla depositada con el Número de Depósito NCIMB 41481 como planta fértil masculina.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el alelo Rf y/o el alelo ms es obtiene de una línea fértil consanguínea de Brassica napus comercialmente disponible 10 seleccionada del grupo que consiste en las variedades no híbridas de Brassica napus comercializadas como semilla para el crecimiento incluidas en la lista de OECD de variedades susceptibles de certificación de diciembre de 2006.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 17 a 18, en el que el fenotipo restaurador de la fertilidad y/o el alelo Rf está ligado a y/o asociado con un marcador de SSR 15 que consisten en la ausencia de un fragmento de PCR con un peso molecular aparente de 240,8 (+/- 0,4) pb que resulta de una reacción de PCR con los cebadores que tienen las secuencias expuestas como SEC ID NO: 19 y 20.

20. Un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo de secuencias descrito por las SEC ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y 20. 20

21. Una sonda que comprende como la parte de ácido nucleico una secuencia seleccionada del grupo de secuencias descritas por SEC ID NO: 11, 12, 17, y 19, en la que la sonda es adecuada para la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido.

22. Una secuencia nucleotídica aislada seleccionada del grupo de las secuencias expuestas como SEC ID NO: 3, 6 y 21, en la que las secuencias nucleotídicas aisladas son 25 marcadores útiles para detectar el alelo Ms, el alelo ms, el alelo Rf y/o el alelo rf en un germoplasma de Brassica y los fenotipos asociados.

23. Uso de una secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 20 ó 22 en una selección a base de marcadores para introgresar alelos seleccionados del grupo que consiste en el alelo Ms, alelo ms, alelo Rf, y/o alelo rf, en un germoplasma de Brassica que carece de dicho conjunto 30 de alelos.

24. Uso de una planta fértil masculina de Brassica napus con el genotipo RfRf en un método de producción de semilla híbrida fértil de Brassica napus según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

25. Uso según la reivindicación 23, en el que el método es un método según una cualquiera 35 de las reivindicaciones 4 a 19.

26. Uso de una o más plantas de Brassica napus seleccionadas de plantas de Brassica napus condicionalmente estériles masculinas con el genotipo MsMsrfrf y/o plantas de Brassica napus fértiles masculinas con el genotipo msmsrfrf, en el método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, y 6 a 19, para producir una planta de Brassica napus condicionalmente estéril masculina con el 40 genotipo Msmsrfrf o semilla de la misma.