Método de producción de plantas masculino- o femenino-estériles,

que comprende la etapa de transformar material vegetal con un polinucleótido que codifica al menos una enzima que reacciona con una sustancia no fitotóxica para producir una fitotóxica, y regenerar el material así transformado en una planta, en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica a la planta hasta el momento de la formación y/o maduración del gameto masculino o femenino, de forma que la sustancia no fitotóxica origina la producción de una fitotóxica que evita selectivamente la formación de los gametos, o bien los vuelve no funcionales, en el que la enzima se expresa en estructuras reproductivas masculinas o femeninas, caracterizado por que: (i) la sustancia no fitotóxica es un D-alfa-aminoácido y (ii) la enzima es una D-aminoácidooxidasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La heterosis en plantas cultivadas tiene un efecto notable en la mejora del rendimiento. En general, los híbridos presentan rendimientos incrementados en comparación con las variedades no híbridas. Los híbridos proporcionan normalmente una unidad de retorno mayor para factores de crecimiento como agua y fertilizante. Los híbridos proporcionan a menudo una tolerancia al estrés superior, uniformidad en el producto y la maduración y proporcionan así mismo una oportunidad sencilla de mejora genética para combinar características o rasgos que puede ser difícil combinar de otras formas. El vigor del híbrido en plantas es de suficiente magnitud, generalmente, para garantizar la explotación comercial. Los híbridos comerciales se usan extensamente en muchos cultivos, incluyendo maíz, sorgo, remolacha azucarera, girasol y colza. Sin embargo, debido principalmente a la falta de métodos económicos de producción de semillas híbridas, el trigo, la cebada y el arroz se cultivan aún principalmente como consanguíneos.

Tradicionalmente, la producción de semillas híbridas implica plantar bloques separados de líneas parentales femeninas y masculinas, cosechándose sólo las semillas de los genitores femeninos. Para asegurar que dicha semilla es híbrida, se tiene que minimizar la autopolinización de la línea parental femenina, haciendo la línea masculino-estéril. Los métodos para hacer la línea parental femenina masculino-estéril incluyen métodos mecánicos, químicos y genéticos. En plantas monoicas como el maíz, la esterilidad masculina se puede conseguir fácilmente mecánicamente mediante despendonación de la inflorescencia masculina. Sin embargo, la mayoría de los cultivos son dioicos y la presencia de órganos masculinos y femeninos en la misma flor hace tal castración inviable. Por tanto, se han usado algunas veces los enfoques genéticos.

Los rasgos de esterilidad genética masculina que aparecen son controlados normalmente por genes nucleares en los que los alelos asociados con el fenotipo estéril se expresan en general de forma recesiva con respecto a los alelos asociados con la fertilidad. Cuando se produce la esterilidad masculina genética está asociada normalmente con un gen recesivo único que tiene que ser homocigoto para que se exprese la esterilidad masculina. A fin de usar de forma práctica tales rasgos de esterilidad masculina genética, los obtentores desarrollan normalmente una línea femenina fenotípicamente uniforme que se segrega en plantas masculino-estériles y plantas femenino-fértiles. Las plantas masculino-estériles, una vez identificadas, se tienen que destruir, lo cual es trabajoso. Existe siempre un problema con el mantenimiento de la línea parental, ya que las plantas masculinas fértiles no se pueden eliminar de la población porque son esenciales para el mantenimiento de la población. Mejor que basarse en la existencia de alelos de esterilidad masculina naturales, es posible también usar los métodos de biología molecular. Se pueden obtener mediante ingeniería genética plantas que expresen, por ejemplo, genes de ribozima o antisentido que reduzcan o eliminen la expresión de genes clave necesarios para la formación de polen viable. Tales líneas transgénicas de plantas son masculino-estériles y se usan para la producción de semillas híbridas mediante cruzamiento, usando polen de plantas masculino-fértiles. El principal problema con tales líneas es que sólo se pueden mantener en un estado hererozigótico en generaciones posteriores mediante cruces con las líneas fértiles isogénicas. Esto puede ser un problema en la producción de semillas híbridas, en la que el rendimiento es crítico. Aunque, por ejemplo ligando la resistencia a herbicida con la esterilidad masculina, se puede destruir selectivamente las plantas masculino-fértiles, esto precisa aún que las plantas se planten inicialmente a densidades extraelevadas.

El uso de esterilidad masculina citoplásmica para la producción de híbridos comerciales requiere un citoplasma masculino-estéril estable y una fuente de polen. El sistema citoplásmico-genético de la esterilidad masculina requiere la existencia de tres tipos de línea para la producción de híbrido: la línea A (masculino-estéril citoplásmica), la línea B (masculino-fértil de mantenimiento) y la línea R (masculino-fértil con genes restauradores). Los cruzamientos en los tres sentidos producidos con este sistema implican el mantenimiento y producción de cuatro líneas, y una línea A y B de un consanguíneo y consanguíneos masculino-fértiles de los otros dos. La confianza en una única fuente de citoplasma masculino-estéril puede minimizar la flexibilidad de la mejora genética y conducir a una descendencia con una gran susceptibilidad global a enfermedades particulares.

Las semillas híbridas se pueden producir también mediante el uso de productos químicos que inhiban la formación de polen viable. Estas sustancias químicas, denominadas gametocidas, se usan para producir esterilidad masculina transitoria. Sin embargo, el coste, registrabilidad y fiabilidad de los gametocidas ha limitado su uso.

Una deficiencia de los sistemas tradicionales de producción de semillas híbridas es la necesidad de plantar filas o bloques separados de las líneas parentales masculina y femenina. En este aspecto, la baja eficiencia de polinización es un problema especialmente grave en especies cultivadas, como el trigo, que liberan pequeñas cantidades de polen que no viaja lejos con el viento. En tales cultivos hasta dos tercios del terreno de producción del híbrido tienen que dedicarse a plantas donantes de polen masculino y consecuentemente, la producción de semillas híbridas se vuelve, por tanto, no rentable.

A fin de conseguir una producción de semillas más rentable en trigo y otros cultivos es necesario desplazar las plantas masculinas y femeninas más próximamente entre sí para una transferencia del polen más eficiente; con la máxima eficiencia mediante plantación intercalada de machos y hembras en las mismas filas a una distancia de centímetros entre ellas. En tal sistema sería inviable cosechar sólo la semilla de los genitores femeninos (masculino-estériles). La contaminación con semilla no híbrida procedente del genitor femenino se puede minimizar usando un porcentaje lo más bajo posible de tales plantas genitoras masculinas en la mezcla para plantar y/o usando plantas masculinas que sean femenino-estériles. Se ha descrito un método para obtener una línea femenino-estéril dominante (EP-412.006-A1 (1991); Goldman et al., (1994) EMBO, J., 13, 2976-2984) pero, como para las líneas masculino-estériles, la línea tiene que mantenerse como heterozigoto.

Consecuentemente, persiste la necesidad de métodos económicos simples de producción de semillas híbridas. En particular, a fin de producir semilla híbrida eficientemente, persiste la necesidad de proporcionar tanto líneas parentales femeninas masculino-estériles, como líneas parentales masculinas femenino-estériles que se puedan mantener fácilmente como líneas homozigóticas puras y que sean útiles para la producción eficiente de semillas híbridas. Los métodos descritos en el estado de la técnica para lograrlo incluyen métodos en los que la semilla híbrida se produce de líneas parentales masculina y femenina, al menos una de las cuales comprende un gen quimérico heterólogo, preferiblemente expresado en el tejido floral, que vuelve a la línea condicionalmente estéril, dependiendo de la aplicación exógena de una sustancia no fitotóxica, que se puede convertir específica y localmente en una fitotoxina, mediante una enzima codificada por el gen quimérico heterólogo y que se expresa preferiblemente, bien en las estructuras reproductivas masculinas o femeninas. La sustancia no fitotóxica puede ser un precursor de herbicida. La ventaja de tener tales líneas parentales condicionalmente estériles es que les permite mantenerse como homozigotas con respecto al rasgo de la esterilidad. La fertilidad se altera sólo tras la aplicación exógena de la sustancia no fitotóxica. En uno de tales ejemplos de un sistema de esterilidad masculina condicional, un gen que codifica la enzima desacetilasa se expresa preferentemente en las células del tapete del tejido floral masculino, donde convierte el precursor de herbicida precursor de herbicida N-acetil-L-fosfinotricina aplicado exógenamente, en la fitotoxina Lfosfinotricina y, por tanto, evita la formación de polen viable. En otros ejemplos similares: (i) la expresión preferencial del tapete del citocromo P450 bacteriano cataliza la conversión del precursor de herbicida R7402 en una fitotoxina sulfonilurea que... [Seguir leyendo]

1.Método de producción de plantas masculino- o femenino-estériles, que comprende la etapa de transformar material vegetal con un polinucleótido que codifica al menos una enzima que reacciona con una sustancia no fitotóxica para producir una fitotóxica, y regenerar el material así transformado en una planta, en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica a la planta hasta el momento de la formación y/o maduración del gameto masculino o femenino, de forma que la sustancia no fitotóxica origina la producción de una fitotóxica que evita selectivamente la formación de los gametos, o bien los vuelve no funcionales, en el que la enzima se expresa en estructuras reproductivas masculinas o femeninas, caracterizado por que: (i) la sustancia no fitotóxica es un D-alfa-aminoácido y (ii) la enzima es una D-aminoácidooxidasa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica mezclada junto con otra sustancia adicional, que se selecciona del grupo que consiste en protectores, gametocidas, inductores de glutatión-S-transferasa, inductores de citocromo P450, herbicidas, fertilizantes, nematocidas, sinergistas, fungicidas, hormonas, reguladores del crecimiento vegetal e inhibidores del citocromo P450.

3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la sustancia no fitotóxica se aplica foliarmente y es un sustrato oxidable, metabólicamente estable, de la enzima, móvil a través del floema, en el que la enzima proporciona el producto fitotóxico, como producto directo o indirecto de la sustancia no fitotóxica.

4. Método según la reivindicación precedente, en el que el producto fitotóxico es un producto indirecto, producido en forma de anión peróxido y/o superóxido.

5.Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que la sustancia no fitotóxica es un D-alfaaminoácido seleccionado del grupo que consiste en D-alanina, D-valina, D-metionina, D-serina, D-leucina y Disoleucina, y dicha enzima es una D-aminoácido-oxidasa que oxida dicho aminoácido hasta un 2-ceto-ácido, con reducción concomitante de oxígeno hasta un anión peróxido. 6.Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que la sustancia no fitotóxica es D-aspartato o Dglutamato y dicha enzima es una D-aminoácido-oxidasa que oxida dicho aminoácido hasta un 2-ceto-ácido, con reducción concomitante de oxígeno hasta anión peróxido.

7.Método según la reivindicación precedente, en el que la enzima es una D-aminoácido-oxidasa mutante, obtenible de Rhodotorula gracilis, la cual comprende sustituciones en las posiciones 213 y/o 238, cuando se compara con la secuencia de tipo silvestre, o es una D-aspartato-oxidasa.

8.Método según la reivindicación precedente, en el que la oxidasa obtenible de Rhodotorula tiene en posición 213 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, ser, Cys, Asn y Ala, y/o en posición 238 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Ser, Cys, Asn y Ala.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que la enzima se dirige a otro punto distinto del peroxisoma.

10. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima es una D-aminoácido-oxidasa y la sustancia no fitotóxica es el enantiómero D de fosfinotricina o el enantiómero D de bialafos.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la sustancia no fitotóxica está comprendida en una mezcla, que contiene una sustancia no fitotóxica, y en el que la enzima es una D-aminoácido-oxidasa, que es capaz de oxidar un aminoácido hasta 2-ceto-ácido con reducción concomitante de oxígeno hasta anión peróxido.

12.Método según la reivindicación precedente, en el que la enzima es una D-aminoácido-oxidasa mutante, obtenible de Rhodotorula gracilis, comprendiendo dicha oxidasa sustituciones en las posiciones 213 y/o 238, cuando se compara con la secuencia de tipo silvestre, o es una D-aspartato-oxidasa.

13.Método según la reivindicación precedente, en el que la oxidasa obtenible de Rhodotorula tiene en posición 213 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, Ser, Cys, Asn y Ala y/o, en posición 238, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Ser, Cys, Asn y Ala.

14.Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la mezcla comprende D- y L-fosfinotricina y el material vegetal expresa un gen PAT, sustancialmente sólo en tejidos verdes y en tejido floral femenino de la planta condicionalmente masculino-estéril y en tejido floral masculino de la planta condicionalmente femenino-estéril.

15. Una casete de expresión de ADN quimérico, que comprende al menos: a.un elemento promotor que funciona en plantas o células vegetales, b.una molécula de ADN que codifica una D-aminoácido-oxidasa, c. un elemento terminador transcripcional, en el que el elemento promotor dirige la expresión de las estructuras reproductivas masculinas o femeninas.

16. Una casete de expresión quimérica según la reivindicación 15, en la que la molécula de ADN que codifica la Daminoácido-oxidasa, se selecciona del grupo de moléculas de ADN aisladas de Rhodosporidium sp., Rhodotorula sp., Trigonopsis sp., pig, Fusarium sp., Candida sp., Schizosaccharomyces sp. y Verticilium sp.

17. Un vector de expresión que comprende una casete de expresión quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16.

18. Una célula de planta transgénica o una planta transgénica que comprende un vector de expresión según se reivindica en la reivindicación 17, o una casete de expresión quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a

16.