METODO IN VITRO DE SELECCION DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTEY USOS DE LOS COMPUESTOS SELECCIONADOS.

Método in vitro de selección de compuestos con actividad antioxidante y usos de los compuestos seleccionados.

La presente invención se refiere a un método (en adelante método de la invención) para ensayar o detectar, in vitro, la capacidad de compuestos o moléculas de inhibir o estimular el daño oxidativo/nitrativo/nitrosativo provocado por ROS y/o RNS en sistemas biológicos, que comprende la inclusión en el medio de reacción de dichas especies reactivas junto con el compuesto o molécula a testar, utilizando la enzima SOD recombinante, caracterizada por la SEQ ID NO: 1, como control positivo de la actividad de dichas ROS y/o RNS

Método in vitro de selección de compuestos con actividad antioxidante y usos de los compuestos seleccionados.

Campo de la invención

La presente invención puede englobarse, de forma general, dentro del campo de la biología pudiendo ser aplicada en gran variedad de sectores de las ciencias de la vida como por ejemplo: biotecnología, bioquímica, medicina, farmacia y química.

Estado de la técnica

En presencia de oxígeno (O₂), se producen en los organismos, especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o de nitrógeno (RNS) las cuales, debido a su elevada reactividad, presentan una vida media muy corta y ejercen importantes acciones deletéreas o dañinas sobre componentes biológicos esenciales, causando numerosas patologías. Por ello la identificación, establecimiento y cuantificación de compuestos y/o moléculas antioxidantes capaces de eliminar, o evitar la formación, de dichas ROS y/o RNS, dentro de las cuales adquiere especial interés el peroxinitrito (ONOO^-) debido a su elevada capacidad dañina de los sistemas biológicos, adquiere en nuestros tiempos un especial y relevante interés.

El ADN es uno de los componentes celulares más susceptible al ataque de las ROS y/o RNS. Dichas especies reactivas pueden alterar o mutar el ADN provocando la emergencia de varios tipos de enfermedades. Dichas especies reactivas han sido asociadas con toda clase de enfermedades degenerativas, artritis, cáncer, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. El peroxinitrito (ONOO^-), por su parte, puede ser directamente o indirectamente responsable de diversas enfermedades y, en concreto, se conoce que es un importante mediador en enfermedades renales (MacMillan-Crow et al., 1996).

El peroxinitrito (ONOO^-) es una especie reactiva altamente oxidante asociada al estrés nitrosativo, con capacidad de oxidar componentes biológicos y causar citotoxicidad (MacMillan-Crow et al., 2001). Se genera a partir del óxido nítrico (NO) junto con el anión superóxido (O₂^-) (Feelisch et al., 1999), siendo dicho anión superóxido uno de radicales considerados como más peligrosos. El peroxinitrito (ONOO^-) puede ser producido in vitro mediante moléculas como el SIN-1, que genera de manera simultánea cantidades equimolares de óxido nítrico (NO) y anión superóxido (O₂^-) (Hogg et al., 1992).

El óxido nítrico (NO) y sus derivados, como el peroxinitrito (ONOO^-), tienen gran importancia en los sistemas biológicos, ya que pueden también mediar en diferentes procesos como son la homeostasis del Fe en plantas, la regulación metabólica de genes, desencadenar la defensa contra patógenos o los mecanismos de inflamación, así como intervenir en diversas enfermedades en animales (Ridnour et al., 2004; Radi et al., 2001; Feelisch et al., 1999; Graziano y Lamattina, 2005). Aunque el metabolismo del peroxinitrito (OONO^-) se ha estudiado en células de mamíferos, los principales estudios realizados se refieren a la síntesis de su precursor, el óxido nítrico (NO) (Gardner et al., 2001).

Una de las enzimas antioxidantes más importante es la superóxido dismutasa (SOD). La SOD es verdaderamente el mecanismo maestro de defensa de las células para atrapar a los radicales libres y prevenir las enfermedades debidas a las mismas (Orr y, Sohal).

Por otro lado, las hemoglobinas son proteínas capaces de unir reversiblemente oxígeno (O₂). Se conocen al menos tres linajes diferentes de hemoglobinas, que se agrupan en dos clases estructurales, denominadas globinas 2/2 y globinas 3/3 dentro de arqueobacterias, eubacterias y los metazoos. La principal función de las globinas 2/2 así como de las flavo-hemoglobinas de bacterias es la detoxificación o eliminación de óxido nítrico (NO). Algunas hemoglobinas han sido propuestas como sensores de oxígeno (O₂), mientras que muchas hemoglobinas de metazoos, así como las hemoglobinas simbióticas, donde se incluyen las leghemoglobinas de plantas, son transportadoras de oxígeno (O₂) sin actividad catalítica conocida (Vinogradov et al., 2005). Por el contrario, las hemoglobinas hexacoordinadas de plantas, al igual que otras hemoglobinas hexacoordinadas de animales (neuroglobina, citoglobina), parecen estar implicadas en la respuesta celular durante condiciones de hipoxia (Dordas et al., 2003a; Dordas et al., 2003b; Kundu et al., 2003; Sun et al., 2001). Las hemoglobinas de clase I (hexacoordinadas), como la hemoglobina I de arroz (Hbt), son un grupo heterogéneo de hemoglobinas y, como hemoglobinas que son, unen oxígeno (O₂) reversiblemente, y además lo hacen con una elevadísima actividad. También se ha evidenciado, utilizando plantas transgénicas, que las hemoglobinas hexacoordinadas vegetales participan en la eliminación de óxido nítrico (NO) (Dordas et al., 2003b; Igamberdiev et al., 2007). Esta misma función de eliminar óxido nítrico (NO) parece ser esencial en las hemoglobinas de otros organismos como bacterias (Gardner et al., 2001), aunque se considera que las funciones catalíticas de las hemoglobinas no están claramente caracterizadas todavía (Vinogradov et al., 2005).

Por otro lado, de modo paradójico, las hemoglobinas pentacoordinadas, como son la hemoglobina o la mioglobina humana, o las leghemoglobinas de leguminosas, exhiben una importante tendencia a autoxidarse espontáneamente, produciendo radical superóxido (Ec.: a.1; Misra y Fridovich 1972; Puppo et al., 1981). El radical superóxido producido es capaz de, a su vez, producir nuevas oxidaciones en la hemoglobina que terminan con su total inactivación

Las hemoglobinas de clase I están presentes en animales, y también en humanos, donde se ha descrito una neuroglobina (Kundu et al, 2003). Aunque se desconoce cuál es exactamente la función fisiológica de las hemoglobinas de clase I, se ha propuesto que forman parte de un sistema respiratorio que, de forma residual, se ha mantenido hasta la actualidad en organismos eucariotas y que tendría especial relevancia en condiciones de anoxia (Igamberdiev et al. 2007).

Existen numerosos bioensayos para estimar el daño oxidativo sobre componentes biológicos producidos por radicales libres como el radical hidroxilo, o incluso para cuantificar peroxidación de lípidos (Halliwell y Gutteridge, 2007). A partir de estos bioensayos en los que se utilizan como moléculas diana desoxirribosa o ácidos grasos (ácido linolénico), respectivamente, se ha podido evaluar la capacidad de numerosas moléculas, potencialmente antioxidantes, para reducir o, a veces, estimular el efecto oxidativo sobre las moléculas diana mencionadas (Moran et al., 1997).

Por otro lado, en los sistemas biológicos, la nitración de los residuos del aminoácido tirosina (Tyr) de las proteínas es producida de manera específica por dicho anión (OONO^-) (Radi, 2001). El ataque del peroxinitrito (ONOO^-) es capaz de provocar la oxidación y la nitración de proteínas tales como la albúmina bovina (BSA) y la superóxido dismutasa (SOD). En la actualidad se conocen muy pocos métodos válidos para detectar especies reactivas de nitrógeno como el peroxinitrito (ONOO^-) o su precursor el óxido nítrico (NO). El tiempo de vida medio para el óxido nítrico (NO) es de 2 ms en eritrocitos (Thomas et al., 2001), por lo que actualmente se depende de mediciones indirectas para identificar y medir sus niveles. La nitración de tirosinas en las proteínas origina la modificación de los residuos de Tyr a 3-nitroTyr. Un sistema para detectar dicha modificación es la utilización de anticuerpos, policlonales o monoclonales, para detectar 3-nitroTyr (Radi, 2001). Entre las proteínas que pueden ser nitradas en los residuos Tyr produciendo su inactivación se encuentran la Mn-superóxido dismutasa (MnSOD) y la Fe-superóxido dismutasa (FeSOD) (Ischiropoulos, 1992a). La primera se ha asociado con procesos degenerativos renales (MacMillan-Crow et al., 1996) y con sistemas modelo de macrófagos activados de alveolo de rata (Ischiropoulos, 1992b). También se ha demostrado que la Cu, ZnSOD, otra SOD, es nitrada por el peroxinitrito en las Tyr cercanas a su centro activo (Ischiropoulos, 1992a), lo que también provoca...

1. Método, in vitro, para seleccionar compuestos o moléculas capaces de inhibir o estimular el estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo provocado por especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o de nitrógeno (RNS) sobre sistemas biológicos, que comprende la inclusión, en el medio de reacción, de dichas especies reactivas junto con el compuesto o molécula del cual se quiere medir y/o detectar dicha capacidad, caracterizado por utilizar una enzima SOD como control positivo de la actividad de dichas especies reactivas.

2. Método, según la reivindicación 1, donde la enzima SOD se caracteriza por ser recombinante y estar representada por la SEQ ID NO: 1.

3. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula ensayada es la hemoglobina.

4. Método, según la reivindicación 3, caracterizado porque la hemoglobina es hexacoordinada.

5. Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque la hemoglobina es la hemoglobina I de arroz.

6. Método, según la reivindicación 3, caracterizado porque la hemoglobina es pentacoordinada.

7. Método, según la reivindicación 6, caracterizado porque la hemoglobina es la leghemoglobina o mioglobina.

8. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque las ROS y/o RNS se seleccionan del grupo: anión superóxido (O₂^-), óxido nítrico (NO), ácido hiponitroso (HNO), anión nitrosilo (NO^-), nitrito (NO₂^-), trioxodinitrato (N₂O₃), catión nitronio (NO₂⁺), radical hidroxilo (^.OH), radical (hidro) peroxilo (^.COO), radical alcoxilo (^.CO), radical carbonato (CO₂^.-), singlete de oxígeno (¹O₂), peróxido de hidrógeno (H₂O₂), ozono (O₃), peroxinitrito (ONOO^-), ácido hipocloroso (HClO), ácido hipobromoso (HBrO), selenito (Na₂SeO₃), oxígeno (O₂), o los precursores de los mismos, así como metales catalíticos que conducen a la formación de especies reactivas como Fe o Cu.