MEDIO DE CRECIMIENTO SELECTIVO.

Un método para cultivar bacterias y detectar una especie bacteria diana,

en el que una muestra, que contiene una mezcla de varias bacterias sospechosa de contener la especie bacteria diana que es una especie de Salmonella, es incubada en presencia de un medio de crecimiento que comprende un compuesto que afecta al crecimiento, caracterizado porque el compuesto que afecta al crecimiento es un pro-inhibidor que no es tóxico para reconocer bacterias, pero que es convertible intracelularmente dentro de al menos alguna especie bacteriana incluyendo al menos una especie bacteriana presente en la muestra, el microbio que se convierte, formando un inhibidor que mata o previene la división del microbio que se convierte, y que es un derivado de aminoacilo u oligopeptidilo de un inhibidor; en el que el pro-inhibidor está representado por la fórmula I general: en la que R 1 es hidrógeno, alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, (cicloalquil C1-C6) - (alquilo C1-C6), arilo o aril-(alquilo C1­ C6) estando dichos sustituyentes diferentes a hidrógeno opcionalmente sustituidos por uno o varios de amino, hidroxi, tio, metiltio, carboxi o guanidino para formar el grupo característico de un L alfa-aminoácido natural; R 2 y R 3 cada uno representan el grupo característico de un aminoácido alfa del tipo encontrado normalmente en proteínas con la condición de que R 3 no puede ser hidrógeno cuando n es cero y R 1 es hidrógeno o fenilo; R 4 es hidroxi o metilo; n es cero, 1, 2 o 3; los asteriscos sencillos significan que la configuración en el átomo de carbono así marcado es L; y el doble asterisco significa que, cuando R 1 es otro distinto al hidrógeno, la configuración en el átomo de carbono así marcado es tal que sería obtenido sustituyendo el grupo carboxilo de un L alfa-aminoácido natural por un resto fósforo y sus sales farmacéuticamente aceptables en el que el medio de crecimiento comprende al menos un sustrato cromogénico que es enzimáticamente convertible en un compuesto diferentemente coloreado o de fluorescencia distinta por el microbio diana

Esta invención se refiere a medios que ayudan al crecimiento de algunos microbios, pero que se diseñan para inhibir el crecimiento de otros tipos de microbios para el cultivo de microbios en una muestra que contiene una mezcla de distintas especies. Dichos medios se llaman medios selectivos. Esta invención comprende un nuevo tipo de medio selectivo. La realización preferida proporciona un medio selectivo con la detección de especies Salmonella, permitiendo que las especies de Salmonella sobrevivan y crezcan e inhibiendo el crecimiento de muchas otras bacterias comensales.

Los laboratorios diagnósticos de microbiología se basan prácticamente en medios de cultivo para el crecimiento de patógenos bacterianos a fin de diagnosticar enfermedades o descubrir bacterias en productos comerciales, tales como productos alimenticios. Estos medios contienen generalmente mezclas no específicas de proteínas ('peptonas') que ayudan al crecimiento bacteriano y pueden emplear agar-agar como agente de solidificación. Una serie enorme de medios está disponible y pueden abarcar desde medios con objetivos generales para el crecimiento de tantas especies como sea posible a medios diseñados para la detección específica de ciertos patógenos. Los medios para patógenos específicos se denominan generalmente agar-agar 'selectivos' con los cuales generalmente se intenta inhibir el crecimiento de bacterias no relacionadas. Se ha empleado una amplia variedad de ingredientes selectivos en los medios incluyendo los antibióticos y diversos productos químicos, tales como sales de bilis y cloruro de sodio.

La mayor parte de los medios son tradicionalmente no específicos y permiten el crecimiento de una amplia variedad de bacterias. Hace falta mucho trabajo entonces para identificar a los patógenos potenciales a partir de una gran cantidad de flora bacteriana. En los últimos años ha habido un cambio hacia el uso de medios cromogénicos que contienen sustratos enzimáticos. Una amplia variedad de dichos medios está disponible y se pueden usar específicamente medios diferentes para reconocer a diferentes patógenos bacterianos. La característica clave de los medios cromogénicos es que el patógeno diana segrega un sustrato enzimático presente en el agar-agar produciendo un producto de color que permanece localizado dentro de la colonia bacteriana. Esto permite la diferenciación de patógenos, apareciendo un cierto color, en microorganismos comensales que en principio son incoloros o que aparecen con otro color. Dichos medios pueden ser bastante sofisticados y pueden incluir un cóctel de sustratos enzimáticos y otros cofactores.

Los medios cromogénicos tienen la ventaja de que son muy específicos para la detección de ciertos patógenos. Como estos patógenos generan un cierto color, se pueden diferenciar fácilmente de las bacterias comensales evitando así la necesidad de pruebas laboriosas en las colonias sospechosas. A pesar de su especificidad y de su facilidad de uso, muchos medios cromogénicos todavía permiten el crecimiento de una amplia variedad de bacterias comensales. Por lo tanto aún es necesario recuperar las colonias bacterianas sospechosas de cultivos de las otras floras. En microbiología diagnóstica, un desafío principal por lo tanto es diseñar medios de cultivo que empleen métodos de detección específicos combinados con una selectividad verdadera respecto a la flora comensal.

Los expertos en la técnica conocen diversos tipos de medios selectivos. Unos han sido diseñados para la detección de Salmonella, incluyendo los medios agar-agar Rambach, agar-agar SM-ID y ABC. En cada caso tiene una importancia intrínseca para el funcionamiento de estos tres medios que las bacterias comensales hidrolicen el sustrato -galactosidasa para generar un producto de color intenso. En comparación, las colonias de Salmonella en cada uno de estos tres medios producen colonias que son de un color más claro debido a una reacción bioquímica secundaria. Una desventaja de los medios selectivos cromogénicos es otra posibilidad de que las colonias sospechosas puedan volverse 'sepultadas' o que crezcan demasiado por colonias de bacterias comensales si el número de bacterias patógenas (especies diana que se detectan) en una muestra es relativamente bajo comparado con la cantidad de las otras bacterias. Este problema se exacerba en los ejemplos, tales como los medios anteriormente mencionados donde las bacterias comensales producen colonias que son muy oscuras y los patógenos dianas producen colonias que son de colores claros.

Hay pruebas para sugerir que un enfoque basado en el sistema cromogénico anteriormente mencionado no es ideal para la recuperación óptima de la Salmonella. Por ejemplo, Dusch H. & Altwegg M (J Clin Microbiol, 993; 31 de febrero, (2):410-2) realizaron una comparación del agar-agar Rambach, agar-agar SM-ID y medio tradicional (Entérico Hektoen) para el aislamiento primario de Salmonella no typhi a partir de muestras de materia fecal. Concluyeron que, aunque los dos medios cromogénicos fueran muy específicos, dadas las pobres sensibilidades, los agar-agar Rambach y SM-ID no podían ser recomendados como medios de preparación de cultivos en placas primarias que seleccionan la Salmonella no typhi.

Los inventores realizaron un estudio para examinar además la selectividad de algunos agar-agar de Salmonella diferentes, es decir, examinaron su capacidad de inhibir cultivos bacterianos comensales comunes encontrados en muestras de materia fecal. Se compraron seis agar-agar de sus proveedores respectivos y se prepararon según las instrucciones exactas del fabricante. Éstos incluyeron los medios agar-agar Rambach (RAM), agar-agar SM-ID, cromagar Salmonella (CS), agar-agar xilosa lisina descarboxilasa (XLD), agar-agar entérico Hektoen (HEK) y ABC. Un total de 433 cepas bacterianas aeróbicas Gram negativo fueron inoculadas en cada uno de estos agar-agar en un inóculo de 10 unidades formadoras de colonia por ml. Esta colección comprendía 61 cepas de Salmonella y 372 cepas que no eran Salmonella. Aunque todos los medios eran eficientes en promover el crecimiento de la Salmonella, la mayoría fue muy ineficaz en la inhibición del crecimiento de las bacterias que no eran Salmonella. Esto se ejemplificó examinando la capacidad de diferentes medios de inhibir el crecimiento de especies comensales de E. coli más comunes presentes en los excrementos. De las 108 cepas probadas, más del 95 % de las cepas creció en los cuatro agar-agar cromogénicos probados: medio SM-ID, Rambach, ABC y Salmonella Cromagar.

Está claro a partir de este ejemplo que hasta entre los sofisticados medios cromogénicos modernos, hay poca selectividad respecto a los cultivos bacterianos comensales encontrados frecuentemente. A menudo se afirma que dichos medios tienen una alta sensibilidad y una especificidad alta. Son sensibles porque ayudarán al crecimiento de una amplia variedad de cepas de Salmonella y pueden ser específicos porque muy pocas cepas que no son de Salmonella producen colonias de colores que tienen las características de la Salmonella. Sin embargo, en términos de la variedad de especies que crecen en estos medios, éstos están lejos de ser específicos y como ya se ha mencionado esto probablemente sería problemático si un pequeño número de bacterias de Salmonella tiene que ser recuperado de una cantidad grande de una flora comensal. Park et al., en Can. J. Microbiol. 1976, 22, 654-657, han descrito un medio de cultivo selectivo que contiene un derivado de -galactosidasa (CPPG) para aislar especies de Shigella o Salmonella de muestras que contienen E. coli. El derivado es secretado por la -galactosidasa de E. coli formando un compuesto citotóxico pero las especies de Shigella no tenían dicha actividad enzimática y crecieron selectivamente.

En el documento WO96/30543 se describe un medio de cultivo para la detección de la Salmonella que comprende un sustrato cromogénico para especies positivas a -galactosidasa de Enterobacteriacae (tales como E. coli) y una mezcla de azúcares que son metabolizados por Salmonella para formar ácidos y un indicador de pH para detectar la formación de ácidos. Se incluyen sales de bilis para enriquecer selectivamente especies Gram positivo (tales como la Salmonella).

Miller et al. en Poultry Science, 1991, 70, 2429-32, describen la incorporación de tergitol para el enriquecimiento selectivo de la Salmonella spp. como una mejora para la novobiocina biocida en medios en los que se detecta Salmonella mediante el uso de estos indicadores, tiosulfato de sodio y citrato de amonio férrico.

Desde hace mucho tiempo hay disponibles agentes... [Seguir leyendo]

1. Un método para cultivar bacterias y detectar una especie bacteria diana, en el que una muestra, que contiene una mezcla de varias bacterias sospechosa de contener la especie bacteria diana que es una especie de Salmonella, es incubada en presencia de un medio de crecimiento que comprende un compuesto que afecta al crecimiento, caracterizado porque el compuesto que afecta al crecimiento es un pro-inhibidor que no es tóxico para reconocer bacterias, pero que es convertible intracelularmente dentro de al menos alguna especie bacteriana incluyendo al menos una especie bacteriana presente en la muestra, el microbio que se convierte, formando un inhibidor que mata

o previene la división del microbio que se convierte, y que es un derivado de aminoacilo u oligopeptidilo de un inhibidor;

en el que el pro-inhibidor está representado por la fórmula I general:

**(Ver fórmula)**

en la que R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, (cicloalquil C1-C6) - (alquilo C1-C6), arilo o aril-(alquilo C1C6) estando dichos sustituyentes diferentes a hidrógeno opcionalmente sustituidos por uno o varios de amino, hidroxi, tio, metiltio, carboxi o guanidino para formar el grupo característico de un L alfa-aminoácido natural; R2 y R3 cada uno representan el grupo característico de un aminoácido alfa del tipo encontrado normalmente en proteínas con la condición de que R3 no puede ser hidrógeno cuando n es cero y R1 es hidrógeno o fenilo; R4 es hidroxi o metilo; n es cero, 1, 2 o 3; los asteriscos sencillos significan que la configuración en el átomo de carbono así marcado es L; y el doble asterisco significa que, cuando R1 es otro distinto al hidrógeno, la configuración en el átomo de carbono así marcado es tal que sería obtenido sustituyendo el grupo carboxilo de un L alfa-aminoácido natural por un resto fósforo y sus sales farmacéuticamente aceptables. en el que el medio de crecimiento comprende al menos un sustrato cromogénico que es enzimáticamente convertible en un compuesto diferentemente coloreado o de fluorescencia distinta por el microbio diana.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el pro-inhibidor es segregado intracelularmente.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que el pro-inhibidor es segregado hidrolíticamente.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que la segregación es enzimática.

25 5. Un método según la reivindicación 1, en el que el pro-inhibidor es un derivado de aminoacilo u oligopeptidilo de fosfalina.

6. Un método según la reivindicación 5, en el que el pro-inhibidor es alafosfalina.

7. Un método según la reivindicación 1, en el que el medio de crecimiento comprende factores de crecimiento para las especies de Salmonella diana, y/o compuestos selectivos.

30 8. Un método según la reivindicación 7, que comprende desoxicolato de sodio y/o citrato de sodio.

9. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho microbio convertible es E. coli.

10. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el medio de crecimiento es un medio sólido.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el medio de crecimiento es un medio agar-agar.

12. Una composición para preparar en un medio de crecimiento bacteriano que comprende nutrientes capaces de

35 ayudar al crecimiento de una muestra de bacterias entéricas variadas y un pro-inhibidor que no es tóxico para las bacterias de interés que son especies de Salmonella, pero que es convertible intracelularmente dentro de al menos alguna especie bacteriana de interés, el microbio que se convierte, para formar un inhibidor que mata o previene la división del microbio que se convierte, y que es un derivado de aminoacilo o peptidilo de un inhibidor;

en el que el pro-inhibidor está representado por la fórmula I general: en la que R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, (cicloalquil C1-C6) - (alquilo C1-C6), arilo o aril-(alquilo C1C6) estando dichos sustituyentes diferentes a hidrógeno opcionalmente sustituidos por uno o varios de amino, hidroxi, tio, metiltio, carboxi o guanidino para formar el grupo característico de un L alfa-aminoácido natural; R2 y R3 cada uno representan el grupo característico de un aminoácido alfa del tipo encontrado normalmente en proteínas con la condición de que R3 no puede ser hidrógeno cuando n es cero y R1 es hidrógeno o fenilo; R4 es hidroxi o metilo; n es cero, 1, 2 o 3; los asteriscos sencillos significan que la configuración en el átomo de carbono así marcado es L; y el doble asterisco significa que, cuando R1 es otro distinto al hidrógeno, la configuración en el átomo de carbono así marcado es tal que sería obtenido sustituyendo el grupo carboxilo de un L alfa-aminoácido natural por un resto fósforo y sus sales farmacéuticamente aceptables,

**(Ver fórmula)**

que comprende además al menos un sustrato cromogénico que es enzimáticamente convertible en un compuesto diferentemente coloreado o de fluorescencia distinta por la especie de Salmonella diana.

13. Una composición según la reivindicación 12, en la que el pro-inhibidor se segrega intracelularmente.

14. Una composición según la reivindicación 13, en la que el pro-inhibidor se segrega hidrolíticamente.

15. Una composición según la reivindicación 13, en la que la segregación es enzimática.

16. Una composición según la reivindicación 12, en la que el pro-inhibidor es un derivado de aminoacilo u oligopeptidilo de fosfalina.

17. Una composición según la reivindicación 16, en la que el pro-inhibidor es alafosfalina.

18. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, que comprende factores de crecimiento para las especies de Salmonella diana, y/o compuestos selectivos.

19. Una composición según la reivindicación 18, que comprende desoxicolato de sodio y/o citrato de sodio.

20. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, que comprende un compuesto acuoso hinchable.

21. Una composición según la reivindicación 20, en la cual el compuesto acuoso hinchable es agar-agar.