Un procedimiento para producir un extracto de piña de pino que comprende las etapas de:

a) extraer en caliente material de piña de pino triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico; b) separar la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 μm, dejando un líquido sobrenadante; c) ajustar el pH del líquido sobrenadante resultante a entre 6,0 y 8,0, caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de: d) filtrar el líquido sobrenadante para obtener una fracción de retenido; e) secar por succión la fracción de retenido y separar las partículas con una masa molecular media menor que 30 kDa; y f) suspender la fracción de retenido en un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico a un pH entre 6,0 y 8,0

Campo de la Invención

La presente invención se refiere en general a la preparación de extractos de piña de pino, a los propios extractos de piña de pino y a los usos de los mismos, en particular como adyuvantes en la vacunación o el tratamiento de vertebrados y como agentes para promover la diferenciación de células sanguíneas.

Antecedentes de la Invención

A medida que los investigadores aumentan la comprensión del sistema inmunitario de los vertebrados, se buscan constantemente procedimientos para aprovechar y usar específicamente el sistema inmunitario para prevenir y luchar contra enfermedades. Debido a la extraordinaria versatilidad del sistema inmunitario, este procedimiento, en principio, ofrece la posibilidad de reaccionar frente a cualquier sustancia de suficiente tamaño. Por lo tanto se han hecho numerosos intentos de establecer procedimientos de vacunación y/o de tratamiento inmunológico del cáncer, infecciones bacterianas y víricas.

Dichos procedimientos de terapia y vacunación normalmente usan la exposición del organismo que se va a tratar (tratamiento in vivo) a preparaciones de vacunas de una sustancia antígena, con el fin de generar una respuesta inmunitaria. En particular, la sustancia antígena (antígeno) se usa para iniciar la producción de inmunoglobulinas y/o células fagocíticas citotóxicas capaces de detectar la propia sustancia antígena o partes de la misma (epítopo), haciéndose así rápidamente reconocible para el sistema inmunitario. Un antígeno como este, se convierte rápidamente en reconocible y puede ser inactivado o destruido, p. ej., mediante la absorción en linfocitos T y posterior desintegración o por destrucción de las células que comprenden el antígeno.

Un procedimiento similar de vacunación o tratamiento es extraer linfocitos, en particular células madre linfocíticas, del organismo que se va a tratar, exponiendo las células extraídas al antígeno, induciendo así la producción de inmunoglobulinas capaces de detectar el antígeno, y después reintroducir los linfocitos que producen inmunoglobulinas en el organismo que se va a tratar (tratamiento ex vivo).

El término “vacunación” indica tratamientos de vertebrados principalmente para prevenir la enfermedad o afección creando, potenciando o manteniendo la capacidad del sistema inmunitario de responder a antígenos correlacionados con la enfermedad o afección. El término “tratamiento” indica crear, potenciar o mantener la capacidad del sistema inmunitario para responder a antígenos correlacionados con una enfermedad o afección después de la primera aparición de la enfermedad o afección, siendo por lo tanto de naturaleza terapéutica. El principio activo en un tratamiento de vacunación se denomina “vacuna”, mientras que el principio activo en un tratamiento terapéutico se denomina “medicamento”. Los términos “vacunación” y “tratamiento” se usan de forma intercambiable, y lo mismo para los términos “vacuna” y “medicamento”.

Uno de los descubrimientos científicos más importantes en los últimos 10 años ha sido la definición de antígenos asociados a tumor (TAA) reconocidos por linfocitos T humanos. Para una recapitulación véase, p. ej., Robbins y Kawakami "Human tumor antigens recognized by T cells", Current Opinion in Immunology 1996, 8:628-636; Rosenberg S.A., "A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens", Immunity 1999, 10:281-287; Van den Eynde B.J. y van der Bruggen P., "T cell defined tumor antigens", Current Opinion in Immunology 1997, 9:684-693. Se cree ampliamente que la identificación y caracterización molecular de los TAA ha proporcionado medios para crear vacunas para el cáncer. Los esfuerzos actuales para crear dichas vacunas se basan en técnicas de inmunización mediada por ácidos nucleicos, es decir, inserción de una o más secuencias que codifican antígenos (p. ej., una secuencia que codifica un TAA) en vectores (huéspedes) de expresión adecuados capaces de producir la expresión de la secuencia que codifica el antígeno directamente en las células transfectadas. El término “secuencia” indica en lo sucesivo un ácido nucleico caracterizado por la secuencia de sus nucleótidos, en el que un ácido nucleico es cualquier molécula que comprende uno o más nucleótidos seleccionados del grupo de adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o sus equivalentes funcionales, como por ejemplo, inosina e hipoxantina, en la que cada nucleobase está unida a una cadena principal que comprende una pentosa tal como ribosa y/o desoxirribosa, y otro azúcar o un aminoácido, y en la que las cadenas principales individuales están unidas/conectadas entre sí, por ejemplo, por enlace fosfodiéster, enlace peptídico u otro medio adecuado de unión/conexión. Los ejemplos de ácidos nucleicos son ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Los vectores hospedadores usados normalmente son bacterias y virus o genomas bacterianos y víricos respectivamente. Estudios recientes han mostrado que no siempre es necesario un vector celular o encapsulado para la preparación de una vacuna. La inmunización con ADN y/o ARN plasmídico “desnudo”, es decir, el ácido nucleico que carece de cualquier otro componente estructural tales como proteínas, lípidos o hidratos de carbono, puede producir respuestas celulares y de anticuerpos potentes. Las vacunas de ácidos nucleicos, también denominadas vacunas recombinantes, son aquellas vacunas en las que el genoma del vector huésped integra una secuencia de ácido nucleico, con frecuencia heteróloga, que codifica un inmunógeno (antígeno).

En comparación con las vacunas basadas en células o lisados celulares, las vacunas recombinantes tienen múltiples ventajas, siendo probablemente la más destacada el que pueden centrar la respuesta inmunitaria contra un solo antígeno específico tal como un TAA, y por lo tanto limitar la posibilidad de desencadenar una agresión autoinmune incontrolada contra antígenos hasta ahora desconocidos que están presentes en tejidos normales y células tumorales.

Actualmente, el éxito de la vacunación y la terapia varían en gran medida para diferentes afecciones e incluso entre los pacientes tratados de la misma afección. Además, la vacunación no siempre dura un tiempo satisfactoriamente largo, sino que puede desaparecer en semanas. Estos inconvenientes siguen siendo ciertos también para una serie de otros procedimientos de vacunación, que pueden implicar en particular la administración de vacunas vivas o inactivadas. En general, las vacunas no siempre pueden generar una respuesta inmunitaria adecuada y eficaz por sí mismas.

Algunas sustancias, cuando se administran simultáneamente con un antígeno específico potenciarán la respuesta inmunitaria para ese antígeno. Dichas sustancias (adyuvantes) se incluyen de forma rutinaria en vacunas de antígenos purificados o inactivados. Son ejemplos de adyuvantes de uso común las sales de aluminio, liposomas y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante de Freund completo e incompleto, dipéptido de muramilo y citocinas tales como interleucina (IL) 2, IL-12 e interferón (IFN) gamma.

Incluso aunque algunos adyuvantes son adecuados en combinación con antígenos o vacunas específicos, pueden fallar en otras combinaciones, o pueden ser ellos mismos tóxicos para vertebrados como seres humanos, promover inmunidad mediada por células pobre, son inestables o son caros y/o difíciles de preparar.

Por lo tanto, las composiciones mejoradas para la vacunación y el tratamiento de enfermedades y afecciones en vertebrados son extremadamente útiles.

Otro aspecto es que para los propósitos científicos, con frecuencia es necesaria la generación de tipos de células específicas, p. ej., para propósitos de cultivo de tejidos. Entre los tipos de células necesarios para la investigación están las células dendríticas y los fibrocitos recientemente descubiertos.

Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno potentes. También se ha descrito que actúan como estimuladoras de una reacción de linfocitos mixtos, para migrar selectivamente a través de los tejidos, absorber, procesar y presentar antígenos, y sirven como células pasajeras que producen rechazo de los tejidos trasplantados. Para una recapitulación véase, por ejemplo, Hart DNJ "Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response", Blood, 1997,...

1. Un procedimiento para producir un extracto de piña de pino que comprende las etapas de:

a) extraer en caliente material de piña de pino triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico;

b) separar la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 m, dejando un líquido sobrenadante;

c) ajustar el pH del líquido sobrenadante resultante a entre 6,0 y 8,0, caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de:

d) filtrar el líquido sobrenadante para obtener una fracción de retenido;

e) secar por succión la fracción de retenido y separar las partículas con una masa molecular media menor que 30 kDa; y

f) suspender la fracción de retenido en un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico a un pH entre 6,0 y 8,0.

2. Un extracto de piña de pino producido por un procedimiento de la reivindicación 1.

3. Un sistema de vacunación y/o terapia, que consiste en una composición o un kit que comprende a) una vacuna o medicamento y b) un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un extracto de piña de pino obtenido por extracción en caliente de piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico, y en el que dicho extracto comprende potasio.

4. El sistema de la reivindicación 3, en el que la vacuna o el medicamento es una vacuna o medicamento de ácido nucleico.

5. Un extracto de piña de pino para usar en la vacunación o tratamiento de un vertebrado, pudiéndose obtener dicho extracto por extracción en caliente de piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico, y comprendiendo dicho extracto potasio.

6. Extracto de piña de pino de la reivindicación 5, extracto de piña de pino que está adaptado para la administración oral, para inyección intramuscular, para inhalación o para la aplicación sobre las mucosas.

7. Extracto de piña de pino de la reivindicación 5, extracto de piña de pino que está adaptado para una vacunación o un tratamiento contra un cáncer y/o una infección vírica.

8. Procedimiento para producir células fibrocitos y/o dendríticas inmaduras y/o maduras, que comprende exponer células seleccionadas del grupo de células sanguíneas mononuclares, timocitos, esplenocitos, células sanguíneas del cordón umbilical, células de la médula ósea, células CD34+, células CD14+ o mezclas de las mismas, a una cantidad eficaz de un extracto de piña de pino, excluyendo procedimientos para el tratamiento del cuerpo

humano o animal por cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal. 9. Procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende exponer las células seleccionadas o la mezcla seleccionada a células CD3+.

10. Adyuvante para administrar antes, durante, simultáneamente con o después de una vacuna, comprendiendo dicho adyuvante un extracto de piña de pino obtenido por extracción en caliente de dicha piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico y comprendiendo dicho extracto potasio.