ENSAYO DE HEMOSTASIA.

Un ensayo de hemostasia que comprende el suministro de una mezcla de reacción que comprende un producto sanguíneo que va a ser comprobado,

una molécula activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por la acción de la trombina produce una señal medible específica de la trombina, una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, una superficie que contiene fosfolípidos, y iones calcio, y la determinación de la cantidad de trombina y la cantidad de plasmina generada en la mezcla de reacción en el tiempo, partiendo de t = 0, midiendo las señales específicas de trombina y de plasmina

Ensayo de hemostasia.

La presente invención se refiere a un ensayo de hemostasia para determinar simultáneamente dos o más parámetros de reacción, en particular la generación de trombina y la generación de plasmina. La invención proporciona además un kit para realizar el ensayo.

En condiciones fisiológicas normales, la hemostasia, la disponibilidad de la sangre para coagularse e impedir la pérdida de sangre, se mantiene en un balance hemostático mediante mecanismos de acción y reacción. El balance hemostático es dependiente de la vía pro- y anticoagulante, como el sistema fibrinolítico y las paredes de los vasos. En el caso en el que el balance hemostático esté fuera de equilibrio, la coagulación patológica (bloqueo de los vasos) o el sangrado (hemorragia) pueden suplantar la hemostasia normal.

Las anormalidades del sistema hemostático pueden ser congénitas o adquiridas. En estos casos es clínicamente esencial diagnosticar, hacer el seguimiento y controlar al paciente con el fin de optimizar la intervención terapéutica.

La mayoría de las pruebas de coagulación implican ensayos de punto final, que detectan el tiempo de coagulación del plasma sanguíneo o el tiempo real de la lisis del trombo por medio de turbidimetría. Aunque realizados de forma rutinaria, los ensayos de coagulación actualmente disponibles tienen limitaciones inherentes que los hacen potencialmente poco fiables como herramientas para llevar a cabo el seguimiento adecuado de la coagulación. Además, no siempre hay una buena correlación entre los resultados de las pruebas de coagulación y la prevención de una hemorragia posoperatoria o de una trombosis recurrente. La mayoría de las limitaciones están relacionadas con el hecho de que son pruebas de punto final que miden el tiempo de formación de coágulos in vitro y requieren la adición de reactivos exógenos (tal como el factor tisular, caolín o iones Ca⁺⁺ para reaprovisionar los fijados por un anticoagulante), y por eso, no necesariamente reflejan el potencial trombótico del paciente (potencial de coagulación).

Comparadas con las pruebas descritas anteriormente, el documento EP-420332 describe un ensayo mejorado de generación de trombina. En este ensayo, no sólo se recopila información sobre la coagulación del plasma sino también sobre la generación total de trombina después de la formación del coágulo. Estos ensayos se realizaron en primer lugar con sustratos cromogénicos y más adelante con sustratos fluorogénicos. Además, se describen varios ensayos de generación de trombina con plasma pobre en plaquetas y rico en plaquetas.

En estos ensayos, de nuevo, la limitación es la medida de una incrementada capacidad de coagulación (trombofilia). La trombofilia es un término usado para describir un grupo de condiciones en las que hay una tendencia incrementada, con frecuencia repetida y con frecuencia durante un largo periodo de tiempo, a la coagulación excesiva. La solicitud de patente internacional WO 03/093831 A describe un método para determinar, en tiempo real, el curso de la actividad de la trombina pero no permite determinar simultáneamente la actividad de la trombina y la actividad de la plasmina.

Existe, por lo tanto, la necesidad de un nuevo ensayo que no tenga los inconvenientes anteriormente indicados, que sea más simple, y pueda medir la fibrinólisis con dependencia de la generación de trombina. El objeto de la invención es proporcionar este ensayo.

En la investigación que condujo a la invención, se desarrolló un nuevo ensayo, en concreto un ensayo fluorimétrico, en el que se puede determinar, simultáneamente en el tiempo, la generación de trombina en un único pocillo. El ensayo de hemostasia de la invención difiere de los ensayos existentes en dos formas. El ensayo de la invención proporciona simultáneamente la detección de la generación de trombina y de plasmina en un único pocillo. Además, el ensayo usa la generación de trombina dependiente de la generación de plasmina, en vez de la adición de trombina o de fibrina. Esto conduce a la posibilidad de medir anormalidades en la coagulación inducidas por aberraciones en la fibrinólisis.

La invención se refiere, por eso, a un ensayo de hemostasia que comprende el suministro de una mezcla de reacción que comprende un producto sanguíneo que va a ser comprobado, una molécula activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por acción de la trombina produce una señal medible específica de la trombina, una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, iones calcio y una superficie que contiene fosfolípidos, y determinar la cantidad de trombina y la cantidad de plasmina generada en la mezcla de reacción en el tiempo, partiendo de t = 0, midiendo las señales específicas de la trombina y de la plasmina.

El ensayo de la invención se puede realizar adecuadamente en un único recipiente. Para ensayos, en gran cantidad, de muestras de sangre, el recipiente en el que el ensayo se realiza adecuadamente es un pocillo de una placa de microvaloración. Estas placas de microvaloración se pueden tratar automáticamente en un equipo que es bien conocido en la técnica. En una realización, los reactivos están adecuadamente contenidos en el recipiente antes de que se añada la muestra de sangre y pueden, por ejemplo, aplicarse a la pared o estar presente en forma liofilizada. Esto es particularmente útil en los kits. Sin embargo, la otra forma también es posible, es decir añadir primero el producto sanguíneo al pocillo y luego los otros reactivos.

El ensayo de la invención se puede usar para determinar la generación de trombina y de plasmina en diversos productos sanguíneos, tales como plasma, sangre entera, líquido de drenaje y plasma rico en plaquetas.

La superficie que contiene fosfolípidos consiste, por ejemplo, en vesículas de fosfolípidos, cefalina, células, en particular células endoteliales, plaquetas sanguíneas, bacterias, virus, matrices de células endoteliales o microvasos, u otras superficies conocidas por las personas expertas en la materia.

La molécula activadora para inducir la generación de trombina es adecuadamente el factor tisular (TF). El TF actúa de mediador en la hemostasia formando complejos con el factor VIIa para convertir directamente X en Xa (vía extrínseca), o indirectamente generando Xa mediante la conversión de IX en IXa, que, a su vez, forma complejo con VIIIa para convertir X en Xa. El factor Xa, una vez generado, forma complejo con su co-factor, Va, para convertir la protrombina (II) en trombina (IIa). Se prefiere el TF porque es el mismo activador que se encuentra en el cuerpo para la vía extrínseca. Los activadores para la vía intrínseca son, por ejemplo, el vidrio, el caolín, la sílice, o un ácido.

La plasmina se forma por la activación de la pro-enzima, plasminógeno, mediante activadores del plasminógeno. Los activadores tisulares del plasminógeno se encuentran en muchos tejidos. El activador tisular del plasminógeno es liberado por las células endoteliales y las plaquetas activadas. La molécula activadora para inducir la generación de plasmina en el ensayo de la invención es, adecuadamente, el activador tisular del plasminógeno (tPA) porque también es el activador en la situación natural en el cuerpo. Ejemplos de otros activadores son la uroquinasa y la estreptoquinasa.

El ensayo de hemostasia de la invención usa, preferiblemente, dos sustratos fluorescentes, uno para la trombina y uno para la plasmina, con diferente excitación fluorescente y espectros de emisión. Después de la ruptura por acción de la trombina del sustrato fluorescente específico de la trombina, se puede determinar la señal fluorescente, después de la excitación, en la longitud de onda de la emisión. Esto mismo es válido para el sustrato fluorescente específico de la plasmina.

Preferiblemente, se eligen dos sustratos fluorescentes, que no interfieran el uno con el otro. En la práctica esto significa que los espectros de los diferentes sustratos fluorescentes no se solapan. El ensayo de la invención se puede por eso llevar a cabo para medir simultáneamente tanto la generación de trombina como la de plasmina. Ambos productos se pueden determinar en tiempo real en un único pocillo usando un fluorímetro equipado con dos conjuntos de filtros. Son ejemplos de sustratos... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de hemostasia que comprende el suministro de una mezcla de reacción que comprende un producto sanguíneo que va a ser comprobado, una molécula activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por la acción de la trombina produce una señal medible específica de la trombina, una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, una superficie que contiene fosfolípidos, y iones calcio, y la determinación de la cantidad de trombina y la cantidad de plasmina generada en la mezcla de reacción en el tiempo, partiendo de t = 0, midiendo las señales específicas de trombina y de plasmina.

2. Un ensayo según la reivindicación 1, en el que el producto sanguíneo que va a ser comprobado se selecciona de plasma, fluido de drenaje, sangre entera y plasma rico en plaquetas.

3. Un ensayo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la molécula activadora para inducir la generación de trombina es un iniciador de la vía extrínseca, en particular el factor tisular (TF), o de la vía intrínseca, en particular vidrio, caolín, un ácido.

4. Un ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula activadora para inducir la generación de plasmina en el ensayo de la invención se selecciona de uroquinasa, estreptoquinasa y activador tisular del plasminógeno y es, preferiblemente, el activador tisular del plasminógeno (tPA).

5. Un ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los sustratos son compuestos que en contacto con la molécula que se va a medir liberan un grupo medible.

6. Un ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los sustratos son sustratos fluorescentes.

7. Un ensayo según la reivindicación 6, en el que los sustratos tienen diferentes espectros de excitación y de emisión.

8. Un ensayo según la reivindicación 7, en el que el sustrato específico de la trombina está unido a 7-amino-4-metilcumarina.

9. Un ensayo según la reivindicación 8, en el que el sustrato específico de la trombina es Bz-β-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH.

10. Un ensayo según la reivindicación 7, en el que el sustrato específico de la plasmina está unido a rodamina 110.

11. Un ensayo según la reivindicación 10, en el que el sustrato específico es la (bis-(amida de la CBZ-L-fenilalanil-L-arginina)).

12. Un ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la superficie que contiene fosfolípidos se selecciona de cefalina, células, en particular células endoteliales, plaquetas sanguíneas, bacterias, virus, matrices de células endoteliales o microvasos.

13. Un ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para usarlo en la determinación de los efectos de fármacos, proteínas, células u otros aditivos tanto en la generación de trombina como en la de plasmina, que comprende la adición del fármaco, la proteína, la célula u otros aditivos a la mezcla de reacción.

14. Un kit para realizar el ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un recipiente que comprende uno o más de los siguientes reactivos: una molécula activadora para inducir la generación de trombina, un sustrato específico de la trombina que tras la ruptura por la acción de la trombina produce una señal medible específica de la trombina, un sustrato específico de la plasmina que tras la ruptura por acción de la plasmina produce una señal medible específica de la plasmina, una molécula activadora para inducir la generación de plasmina, una superficie que contiene fosfolípidos, y iones calcio.

15. Un kit según la reivindicación 14, en el que la molécula activadora para inducir la generación de trombina es un iniciador de la vía extrínseca, en particular el factor tisular (TF) o un iniciador de la vía intrínseca, en particular vidrio, caolín, un ácido.

16. Un kit según la reivindicación 14, en el que la molécula activadora para inducir la generación de plasmina en el ensayo de la invención se selecciona de uroquinasa, estreptoquinasa, y activador tisular del plasminógeno y es, preferiblemente, el activador tisular del plasminógeno (tPA).

17. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que los sustratos son compuestos que en contacto con la molécula que se va a medir liberan un grupo medible.

18. Un kit según la reivindicación 14, 15 ó 16, en el que los sustratos son sustratos fluorescentes.

19. Un kit según la reivindicación 18, en el que los sustratos tienen diferentes espectros de excitación y de emisión.

20. Un kit según la reivindicación 19, en el que el sustrato específico de la trombina está unido a 7-amino-4-metilcumarina.

21. Un kit según la reivindicación 19, en el que el sustrato específico de la trombina es Bz-β-Ala-Gly-Arg-AMC-AcOH.

22. Un kit según la reivindicación 19, en el que el sustrato específico de la plasmina está unido a rodamina 110.

23. Un kit según la reivindicación 22, en el que el sustrato específico de la plasmina es la (bis-(amida de la CBZ-L-fenilalanil-L-arginina)).