Procedimiento para el diagnóstico de la diabetes de tipo II, que comprende medir un nivel de adiponectina natural (GBP28) que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para realizar el diagnóstico o control de trastornos del metabolismo de los carbohidratos mediante el ensayo de la adiponectina natural (GBP28) en una muestra, a un procedimiento para el control de los efectos terapéuticos de agentes para la diabetes de tipo II mediante el ensayo de GBP28 natural en una muestra, a un procedimiento para el ensayo de GBP28 caracterizado por el ensayo de GBP28 natural en una muestra, y a un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con GBP28 natural. La GBP28 natural presenta una estructura de trímero agregado constituido por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural.

Antecedentes de la técnica

Existen 100.000.000 ó más pacientes que sufren diabetes en todo el mundo, y 90% o más de los mismos presentan diabetes de tipo II (Schoonjans K. y Auwerx J., Lancet 355:1008-1010, 2000). La diabetes de tipo II se caracteriza por alteraciones de la secreción de la insulina y/o resistencia a la insulina (DeFronzo R.A. et al., Diabetes Care 15:318-368, 1992). Se ha descubierto tanto en experimentos animales como en estudios clínicos que las tiazolidinedionas mejoran la resistencia a la insulina. Al administrar dichos agentes en pacientes con diabetes de tipo II, se elevó la acción de la insulina. Esto resultó adversamente en niveles bajos de glucosa en sangre, de glucohemoglobina y de insulina sérica (Schwartz S. et al., N. Engl. J. Med. 338:861-866, 1998).

La adiponectina, que es una proteína plasmática derivada del adipocito (Maeda K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221:286-289, 1996; Arita Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:79-83, 1999) (también conocida como proteína de unión a la gelatina de 28 kDa (GBP28) (Nakano Y. et al., J. Biochem. 120:803-812, 1996; Saito K. et al., Gene 229:67-73, 1999; Saito K. et al., Biol. Pharm. Bull. 22:1158-1162, 1999)), se adhiere a las paredes vasculares dañadas in vitro, bloquea la transmisión de señales de NF-κB endodérmico (Ouchi N. et al., Circulation 102:1296-1301, 2000) e inhibe la proliferación celular de los músculos lisos inducida por HB-EGF y PDGF (Matsuzawa Y. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 892:146-154, 1999). En el caso de los pacientes con obesidad, se ha informado de niveles séricos bajos de esta proteína (Arita Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:79-83, 1999). En el caso de los pacientes con diabetes de tipo II y de los que presentan enfermedades arteriales coronarias, se ha informado de que los niveles séricos mencionados anteriormente son reducidos (Hotta K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20:1595-1599, 2000).

En el pasado, factores tales como la glucosa en sangre, HbA1C, la insulina sérica, HOMA-IR, y similares se han conocido como factores asociados a la diabetes de tipo II. Sin embargo, estos factores eran insuficientes en términos de operabilidad y/o sensibilidad como indicadores para el diagnóstico de la diabetes de tipo II o para el control de efectos terapéuticos. Tal como se ha indicado anteriormente, también se ha sugerido la asociación de GBP28 con la diabetes de tipo II. Sin embargo, no se clarificó suficientemente si GBP28 era realmente aplicable al diagnóstico de la diabetes de tipo II y al control de los efectos terapéuticos en el campo clínico.

La técnica ELISA de Ohmoto et al. es conocida como procedimiento para el ensayo de GBP28 (Ohmoto et al., BIO Clinica 15(10):758-761, 2000; publicación de patente japonesa abierta al público (Kokai) nº 2000-304748). La GBP28 natural en la sangre está constituida por 3 monómeros, y se agregan 4 a 6 trímeros (J. Biochem. 120:803-812, 1996). Sin embargo, el procedimiento de la técnica convencional mencionada anteriormente se complica debido a la utilización de un anticuerpo monoclonal para que GBP28 presente una estructura monomérica. Esto requirió la desnaturalización de la GBP28 natural en la muestra, la mezcla del espécimen con una solución de SDS en el momento del ensayo y la realización del tratamiento térmico a 100ºC. Esta técnica convencional consistía en someter a ensayo la GBP28 natural en un estado desnaturalizado. Por lo tanto, no podía someter a ensayo directamente la GBP28 en su estado natural.

Sumario de la invención

Con el fin de superar los problemas indicados anteriormente, se sometieron a ensayo las concentraciones sanguíneas de una diversidad de parámetros asociados a la diabetes de tipo II en los pacientes con esta enfermedad. También se llevaron a cabo estudios concentrados con el fin de descubrir factores que pudiesen ser indicadores clínicos para el diagnóstico de trastornos del metabolismo de los carbohidratos tales como la diabetes de tipo II y el control de los efectos terapéuticos de agentes para la diabetes de tipo II. Como resultado, se descubrió que el ensayo de la GBP28 natural resultaba muy efectivo para el diagnóstico de los trastornos del metabolismo de los carbohidratos y para el control de los efectos terapéuticos de los agentes para ello, tal como se describe en los ejemplos, a continuación. También encontraron que GBP28 en una muestra podía someterse a ensayo simple y rápidamente en su estado natural mediante el ensayo de GBP28 en una forma agregada. Esto condujo a completar la presente invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona lo expuesto a continuación, (1) a (9).

(1) Un procedimiento para el diagnóstico de la diabetes de tipo II, que comprende medir un nivel de adiponectina natural (GBP28) que presenta una estructura de trímeros agregados de GBP28 constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

(2) Un procedimiento para el control de los efectos terapéuticos de agentes terapéuticos para la diabetes de tipo II, que comprende medir un nivel de adiponectina natural (GBP28) que presenta una estructura de trímeros agregados de GBP28 constituida por entre 4 y 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

(3) El procedimiento según (2), anteriormente, en el que los agentes para la diabetes de tipo II son derivados tiazolidina.

(4) Un procedimiento para proporcionar un indicador de resistencia a la insulina, que comprende medir un nivel de GBP28 natural que presenta una estructura de trímeros agregados de GBP28 constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

(5) El procedimiento según (4), anteriormente, en el que el indicador de resistencia a la insulina es un indicador de la resistencia a la insulina para individuos sanos.

(6) El procedimiento según cualquiera de entre (1) y (5), anteriormente, en el que la medición se lleva a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que no reaccione con una estructura monomérica de GBP28, pero que reaccione específicamente con GBP28 natural que presenta una estructura de trímeros agregados de GBP28 constituida por entre 4 y 6 trímeros de GBP28 en su estado natural.

(7) Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que no reaccione con una estructura monomérica de GBP28 pero que reaccione específicamente con GBP2828 natural que presenta una estructura de trímeros agregados de GBP28 constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28.

(8) El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según (7), anteriormente, producido a partir del hibridoma FERM BP-7660 o FERM BP-7661.

(9) Un kit o reactivo para medir el nivel de GBP28 natural en una muestra, que comprende un anticuerpo monoclonal

o fragmento del mismo según (7) u (8), anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa esquemáticamente los principios del procedimiento según la presente invención y los de las técnicas convencionales.

La figura 2 representa los cambios de los niveles de adiponectina sérica causados por la administración durante tres meses de pioglitazona (30 mg/día) en 10 pacientes que presentan diabetes de tipo II (japoneses varones), en la que "O-O" representa la terapia de dieta y la administración de pioglitazona (n=7) y "■-■" representa la terapia de dieta y la administración de sulfonilurea y pioglitazona (n=3).

La figura 3 representa la curva de calibración para GBP28.

La figura 4 representa la linealidad de dilución para el ensayo de GBP.

Mejores modos de poner en práctica la invención

La GBP28 en el ser humano es conocido que presenta la secuencia de aminoácidos representa en SEC ID nº 1 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID nº 2. Es conocido que GBP28 en la sangre forma 4 a 6 trímeros agregados, estando constituida cada una por 3 monómeros... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el diagnóstico de la diabetes de tipo II, que comprende medir un nivel de adiponectina natural (GBP28) que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

2. Procedimiento para el control de los efectos terapéuticos de los agentes terapéuticos para la diabetes de tipo II, que comprende medir un nivel de adiponectina natural (GBP28) que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que los agentes terapéuticos para la diabetes de tipo II son los derivados de tiazolidina.

4. Procedimiento para proporcionar un indicador de la resistencia a la insulina, que comprende medir un nivel de GBP28 natural que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28 en su estado natural en una muestra.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el indicador de resistencia a la insulina es un indicador de la resistencia a la insulina para los individuos sanos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la medición se lleva a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que no reaccione con una estructura monomérica de GBP28 pero que reacciona específicamente con GBP28 natural que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28.

7. Anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, que no reacciona con una estructura monomérica de GBP28 pero que reacciona específicamente con GBP28 natural que presenta una estructura de trímeros de GBP28 agregados constituida por 4 a 6 trímeros de GBP28.

8. Anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo monoclonal es producido a partir del hibridoma FERM BP-7660 o FERM BP-7661.

9. Kit o reactivo para medir un nivel de GBP28 natural, que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según la reivindicación 7 u 8.