Un procedimiento de cromatografía de desplazamiento, que comprende:

cargar en una fase estacionaria apropiada una mezcla que comprende uno o más componentes que se van a separar; desplazar por lo menos uno, del uno o más componentes de la fase estacionaria aplicando a la fase estacionaria una mezcla que comprende un compuesto desplazante que tiene la fórmula general (I): en la que: cada grupo R1, R2, R3, R'1, R'2, y R'3, independientemente se puede seleccionar de alquilo, arilo, y aralquilo, y en el que se puede formar un anillo que contiene uno o más nitrógenos cuaternarios con uno o más de R1 y R2, R1 y R'1, R1 y R4, R4 y R'4, o R4 y R5; cada R4, R'4, R5 y R'5 independientemente se puede seleccionar de alquilo, arilo, aralquilo y -(CH2)a-(CHY)b­ (CH2)c-N + R1R2R3An - , en la que R1, R2 y R3 son como se define anteriormente; cada Y independientemente se puede seleccionar de -H, -OH, -OR6, halo, alquilo, arilo y aralquilo, en la que -R6 puede ser alquilo o -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N + R1R2R3An - , en la que R1, R2 y R3 son como se define anteriormente, y uno o más Y puede ser un grupo detectable por uno o más métodos electromagnéticos; cada q y z independientemente puede ser cualquier número entero de 0 a 6, con la condición de que q+z sea igual o menor de 6; cada a, b y c independientemente puede ser cualquier número entero de 0 a 2, con la condición de que la suma de a+b+c en cualquier fragmento sea por lo menos 1; y cada An - independientemente puede ser uno o más aniones monovalentes o polivalentes, orgánicos o inorgánicos según sea necesario para obtener un compuesto neutro

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a procedimientos de cromatografía de desplazamiento y a una composición respectiva para ellos.

ANTECEDENTES

El modo de desplazamiento de cromatografía fue reconocido primero en 1906 por Tswett, que advirtió que ocurría un desplazamiento de la muestra en condiciones de cromatografía de elución sobrecargada. En 1943, Tiselius propuso que la amplia materia de la cromatografía se podría organizar alrededor de tres distintos “modos”: modo frontal, modo de elución y modo de desplazamiento. Desde entonces, la mayor parte de los desarrollos y aplicaciones, particularmente aquellos en cromatografía analítica, han tenido lugar en el área de la cromatografía de elución. Ciertamente, el término “cromatografía” sin calificación adicional hoy se refiere usualmente a cromatografía en el modo de elución.

El modo de elución y el modo de desplazamiento se distinguen fácilmente tanto en la teoría como en la práctica. En cromatografía de elución, una disolución de la muestra a purificar se aplica a una fase estacionaria, comúnmente en una columna. La fase móvil se escoge de tal modo que la muestra ni se adsorbe irreversiblemente ni no se adsorbe totalmente, sino que en su lugar se une reversiblemente. A medida que se hace fluir la fase móvil sobre la fase estacionaria, se establece un equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria por lo que, dependiendo de la afinidad por la fase estacionaria, la muestra pasa a lo largo de la columna a una velocidad que refleja la afinidad relativa respecto a otros componentes que pueden estar presentes en la muestra original. Es de interés particular en cromatografía de elución estándar el hecho de que el frente del disolvente de elución, o volumen cero de la columna en elución isocrática, siempre precede a la muestra a la salida de la columna.

Una modificación y extensión de la cromatografía de elución isocrática se encuentra en la cromatografía de gradiente en etapas en la que se hacen pasar sobre la fase estacionaria una serie de eluyentes de composición variable. En cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, se emplean cambios por etapa en la concentración de sal y/o pH de la fase móvil para eluir o desorber analitos que se están separando.

La cromatografía de desplazamiento emplea un compuesto desplazante para retirar componentes de una mezcla de la columna. El compuesto desplazante generalmente tiene una afinidad mucho más alta por la fase estacionaria que cualquiera de los componentes en la mezcla que se va a separar. Esto contrasta con la cromatografía de elución, en la que el eluyente tiene una afinidad más baja por la fase estacionaria que los componentes que se van a separar. Una característica operacional clave que distingue la cromatografía de desplazamiento de la cromatografía de elución o desorción es el uso de un compuesto desplazante. En cromatografía de desplazamiento, la columna se equilibra primero con un disolvente portador en condiciones en las que los componentes que se van a separar tienen todos una afinidad relativamente alta por la fase estacionaria. Un volumen de mezcla de alimentación, que puede ser grande y bastante diluido, se carga sobre la columna y los componentes individuales en la mezcla de alimentación se adsorberán en la fase estacionaria. Esto es, los componentes de la mezcla de alimentación se distribuyen y adsorben sobre la fase estacionaria, y permanecen allí. Si todos los componentes se van a resolver por desplazamiento, el disolvente portador emerge de la columna sin contener muestra. Los componentes de la mezcla de alimentación ahora residen sobre la fase estacionaria, y la posición de cada componente sobre la columna está correlacionada con su afinidad relativa por la fase estacionaria en las condiciones iniciales. En principio, una molécula de cualquier componente desplazará a una molécula de cualquier componente diferente que tenga una afinidad más baja en un sitio dado en la fase estacionaria. Como resultado, los componentes individuales estarán colocados sobre la columna finalmente en una secuencia de la más alta a la más baja afinidad.

A veces es ventajoso permitir que algunos componentes de la mezcla de alimentación, por ejemplo, los componentes que no tienen una afinidad significativa por la fase estacionaria, pasen a través de la columna con el disolvente portador; en este caso solo se resolverán por cromatografía de desplazamiento los componentes de la alimentación retenidos.

Una vez que se ha cargado la muestra en la columna, se introduce dentro de la columna una disolución que contiene un compuesto desplazante en un disolvente apropiado para pasar a través de la fase estacionaria. EL compuesto desplazante se selecciona de tal modo que tenga una afinidad más alta por la fase estacionaria que cualquiera de los componentes de la mezcla de alimentación. Suponiendo que el desplazante y la fase móvil son apropiadamente escogidos, los componentes individuales salen de la columna como zonas adyacentes de material relativamente puro altamente concentrado en el orden de afinidad de absorción creciente. Después de las zonas de los componentes individuales purificados, emerge de la columna el desplazante. Un cromatograma de desplazamiento se distingue fácilmente de un cromatograma de elución en virtud del hecho de que el compuesto desplazante sigue a la muestra y de que los componentes de la alimentación salen de la columna como zonas adyacentes de material relativamente puro altamente concentrado.

La cromatografía de desplazamiento tiene algunas características particularmente ventajosas para cromatografía a escala de proceso. Primero, la cromatografía de desplazamiento puede conseguir la separación y concentración de producto en una sola etapa. Por comparación, la cromatografía de elución isocrática da como resultado una dilución significativa del producto durante la separación. Segundo, dado que el proceso de desplazamiento funciona en la región no lineal de la isoterma de equilibrio, son posibles altas cargas de la columna. Esto permite una mucho mejor utilización de la columna que la cromatografía de elución. Tercero, el revelado de la columna y la separación de componentes requiere menos disolvente que un procedimiento de elución comparable. Cuarto, la cromatografía de desplazamiento puede concentrar y purificar componentes de mezclas que tienen bajos factores de separación, mientras que se requieren relativamente grandes factores de separación para la resolución satisfactoria en cromatografía de elución típica.

Con todas estas ventajas, se podría suponer que la cromatografía de desplazamiento fuera muy utilizada. Sin embargo, han persistido los problemas en cromatografía de desplazamiento. Uno de tales problemas es la necesidad de regenerar la columna, dado que no sería económico tirar la fase estacionaria después de cada uso. Otro de tales problemas es obtener compuestos desplazantes apropiados que sean compuestos relativamente simples, fácilmente sintetizados y/o comercialmente disponibles a un coste (económico) razonable. Estos dos problemas han presentado inconvenientes significativos para la cromatografía de desplazamiento cara a cara con la cromatografía de elución.

Con respecto a la regeneración, dado que el procedimiento de desplazamiento usa un compuesto desplazante con una afinidad muy alta por la fase estacionaria, el tiempo necesario para regenerar y reequilibrar la columna puede ser prolongado comparado con la cromatografía de elución. Además, se requieren a menudo cantidades relativamente grandes de disolvente durante la regeneración. Estos problemas han reducido efectivamente las ventajas de la cromatografía de desplazamiento sobre la cromatografía de elución.

El segundo problema, el de obtener compuestos desplazantes útiles que se puedan sintetizar con relativa facilidad y/o que estén comercialmente disponibles a un coste (económico) razonable, es debido a la necesidad de un compuesto desplazante que tenga tanto una alta afinidad por la fase estacionaria como que también pueda ser retirado con relativa facilidad de la columna durante la regeneración. Tales compuestos que han sido ofrecidos por la técnica anterior no cumplen uno o ambos de estos dos importantes criterios. Se han ofrecido varios compuestos como desplazantes de bajo peso molecular, pero estos han sido bastante difíciles de sintetizar y purificar y no han estado comercialmente disponibles a un coste razonable, o simplemente no han estado comercialmente disponibles.

Para que la cromatografía de desplazamiento se... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cromatografía de desplazamiento, que comprende:

cargar en una fase estacionaria apropiada una mezcla que comprende uno o más componentes que se van a separar;

desplazar por lo menos uno, del uno o más componentes de la fase estacionaria aplicando a la fase estacionaria una mezcla que comprende un compuesto desplazante que tiene la fórmula general (I):

**(Ver fórmula)**

en la que: cada grupo R1, R2, R3, R'1, R'2, y R'3, independientemente se puede seleccionar de alquilo, arilo, y aralquilo, y en el que se puede formar un anillo que contiene uno o más nitrógenos cuaternarios con uno o más de R1 y R2, R1 y R'1, R1 y R4, R4 y R'4, o R4 y R5;

cada R4, R′ 4, R5 y R′ 5 independientemente se puede seleccionar de alquilo, arilo, aralquilo y -(CH2)a-(CHY)b(CH2)c-N+R1R2R3An−, en la que R1, R2 y R3 son como se define anteriormente;

15 cada Y independientemente se puede seleccionar de -H, -OH, -OR6, halo, alquilo, arilo y aralquilo, en la que -R6 puede ser alquilo o -(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An−, en la que R1, R2 y R3 son como se define anteriormente, y uno o más Y puede ser un grupo detectable por uno o más métodos electromagnéticos;

cada q y z independientemente puede ser cualquier número entero de 0 a 6, con la condición de que q+z sea igual o menor de 6; cada a, b y c independientemente puede ser cualquier número entero de 0 a 2, con la condición de que la suma de a+b+c en cualquier fragmento sea por lo menos 1; y

cada An- independientemente puede ser uno o más aniones monovalentes o polivalentes, orgánicos o inorgánicos según sea necesario para obtener un compuesto neutro.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la fase estacionaria es un material de intercambio 25 catiónico.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el uno o más componentes comprenden uno o más polipéptidos, una o más proteínas o una mezcla de dos o más cualquiera de ellos.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que una proteína y/o polipéptido de la mezcla

es desplazado de la fase estacionaria en una fracción en la que la proteína y/o polipéptido se enriquece y/o en la 30 que la proteína y/o polipéptido se separa de otros componentes de proteína y/o polipéptido.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la mezcla comprende por lo menos dos componentes que se van a separar o la mezcla comprende por lo menos un componente y por lo menos una impureza.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente detectar el

35 compuesto desplazante según emerge de la fase estacionaria, en el que la detección es por uno o más de, espectroscopía de absorción UV/Visible, espectroscopía de emisión fluorescente, espectrometría de masas, pH, conductividad y uno o más métodos electroquímicos.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente regenerar la fase estacionaria.

40 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la regeneración comprende tratar la fase estacionaria con una disolución de uno o más de, un hidróxido de metal alcalino, una sal de metal alcalino, un hidróxido alcalinotérreo, una sal alcalinotérrea, un ácido orgánico, un ácido alquilsulfónico, un hidróxido de amonio cuaternario, una sal de amonio cuaternario, una alquilamina, en el que la disolución puede comprender adicionalmente un tampón de pH apropiado o la regeneración comprende tratar la fase estacionaria con una disolución que comprende agua y un co-disolvente orgánico.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que: el compuesto desplazante es DBQ, que tiene una estructura:

**(Ver fórmula)**

o el compuesto desplazante es BTA, que tiene una estructura:

**(Ver fórmula)**

en los que cada An- independientemente puede ser uno o más aniones monovalentes o polivalentes, orgánicos o inorgánicos según sea necesario para obtener un compuesto neutro.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la mezcla comprende: uno o más anticuerpos naturales o recombinantes o una mezcla de dos o más cualquiera de tales anticuerpos; o una o más enzimas naturales o recombinantes o una mezcla de dos o más cualquiera de tales enzimas; o una o más proteínas y/o polipéptidos naturales o recombinantes para uso en diagnóstico, o una mezcla de dos o

más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o

una o más proteínas o polipéptidos naturales o recombinantes para uso terapéutico humano o veterinario, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más plasmas de sangre humana o animal natural o

recombinante o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o

una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más materiales vegetales naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o una o más proteínas o polipéptidos derivados de una o más leches humanas o animales o leche derivada de un

animal recombinante, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o

una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más huevos aviares naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más bacterias, levaduras, hongos, virus o insectos

naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o

una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más cultivos celulares o tejidos animales de mamíferos naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o uno o más compuestos orgánicos, fármacos o intermedios de fármacos, o una mezcla de dos o más cualquiera

de ellos.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que uno o más de los uno o más compuestos orgánicos, fármacos o intermedios de fármacos es quiral.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la mezcla comprende uno o más componentes traza, y el procedimiento comprende adicionalmente una o más de detección, recogida o cuantificación de los componentes traza en la mezcla.

13. Una composición desplazante útil en cromatografía de desplazamiento, que comprende, en una disolución acuosa apropiada, un compuesto que tiene la estructura:

**(Ver fórmula)**

en la An- independientemente puede ser uno o más aniones monovalentes o polivalentes, orgánicos o inorgánicos según se necesite para obtener un compuesto neutro.