Procedimiento de cromatografía de desplazamiento de intercambio aniónico.

Un procedimiento de cromatografía de desplazamiento, que comprende:

cargar en una fase estacionaria que comprende un material de intercambio aniónico una mezcla que comprende uno o más componentes a separar;

desplazar al menos uno del uno o más componentes de la fase estacionaria aplicando a la fase estacionaria una mezcla que comprende un compuesto desplazador polianiónico poliaromático que tiene la fórmula general:

Cen (Ar)w

en la que Cen ≥ un anillo de benceno, un bifenileno, un naftileno,

en la que :

w ≥ 2 al mayor número de posiciones sustituibles en Cen; y

Ar ≥ (a), (b) y/o (c); y en donde, en los siguientes (a), (b) y (c):

An- ≥ independientemente, sulfonato, carboxilato, fosfonato, fosfinato, fosfato, un fosfato mono- o di-éster, sulfato, un sulfato mono-éster; o boronato;

G ≥ independientemente H, alquilo C1 - C6, alquenilo C1 - C6, arilo C6 - C10, halógeno, nitro, hidroxi, alcoxi C1 - C6, ciano, -NH2, -NRH, -NR2, -NHC(O)R, -CHO, -C(O)R; y

(a), (b) y (c) son:

(a)**Fómula**

en donde en (a)

x ≥ 2 o 3

y ≥ 3 o 2

x + y ≥ 5; y/o

(b)**Fórmula**

Procedimiento de cromatografía de desplazamiento de intercambio aniónico Campo Técnico La presente invención se refiere a procedimientos para usar composiciones que comprenden sales múltiples de aniones orgánicos (aniones múltiples) , como desplazadores en purificaciones cromatográficas por desplazamiento de intercambio aniónico.

Fundamento El modo de desplazamiento de la cromatografía fue reconocido por vez primera en 1906 por Tswett, que observó que el desplazamiento de la muestra tenía lugar bajo condiciones de cromatografía de elución sobrecargada. En 1943, Tiselius propuso que el amplio tema de la cromatografía se podría organizar alrededor de tres "modos” distintos: modo frontal, modo de elución, y modo de desplazamiento. Desde entonces, la mayor parte de los desarrollos y aplicaciones, en particular los de la cromatografía analítica, han tenido lugar en el área de la cromatografía de elución. En realidad, el término "cromatografía" sin más cualificación suele referirse actualmente a la cromatografía en el modo de elución.

El modo de elución y el modo de desplazamiento son fáciles de distinguir tanto en la teoría como en la práctica. En la cromatografía de elución, se aplica una solución de la muestra a purificar a una fase estacionaria, por lo general en una columna. La fase móvil se elige de forma tal que la muestra ni se adsorbe irreversiblemente ni queda totalmente sin adsorber, sino que más bien se une de forma reversible. A medida que la fase móvil fluye sobre la fase estacionaria, se establece un equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria por el cual, dependiendo de la afinidad por la fase estacionaria, la muestra pasa a lo largo de la columna a una velocidad que refleja su afinidad en relación con otros componentes que pueden estar presentes en la muestra original. Es de un interés particular en la cromatografía de elución estándar el hecho de que el frente de disolvente eluyente, o volumen de columna cero en la elución isocrática, siempre precede a la muestra fuera de la columna.

Una modificación y extensión de la cromatografía de elución isocrática se encuentra en la cromatografía de gradiente en etapas en la que se hace pasar una serie de eluyentes de composición variable sobre la fase estacionaria. En la cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, los cambios en etapa en la concentración salina de la fase móvil y/o el pH se emplean para eluir o desorber analitos sometidos a separación.

La cromatografía de desplazamiento emplea un compuesto desplazador para eliminar de la columna los componentes de una mezcla. El compuesto desplazador generalmente tiene una afinidad para la fase estacionaria mucho mayor que cualquiera de los componentes de la mezcla a separar. Esto contrasta con la cromatografía de elución, en el que el eluyente tiene una afinidad por la fase estacionaria más baja que los componentes que se han de separar. Una característica operativa clave que distingue la cromatografía de desplazamiento de la cromatografía de elución o de desorción es el uso de un compuesto desplazador. En la cromatografía de desplazamiento, la columna se equilibra primero con un disolvente portador en condiciones en las que los componentes a separar tienen todos ellos una afinidad relativamente alta para la fase estacionaria. Un volumen de mezcla de alimentación, que puede ser grande y bastante diluido, se carga en la columna y los componentes individuales de la mezcla de alimentación se adsorben a la fase estacionaria. Es decir, los componentes de la mezcla de alimentación se distribuyen y se adsorben en la fase estacionaria, y se mantienen allí. Si todos los componentes se han de resolver por desplazamiento, el disolvente portador emerge de la columna sin contener muestra. Los componentes de la mezcla de alimentación residen ahora en la fase estacionaria, y la posición de cada componente en la columna se correlaciona con su afinidad relativa para la fase estacionaria bajo las condiciones iniciales. En principio, una molécula de cualquier componente desplazará a una molécula de cualquier componente diferente que tiene una afinidad más baja en un sitio dado en la fase estacionaria. Como resultado, los componentes individuales se dispondrán finalmente en la columna en una secuencia de mayor a menor afinidad.

A veces es ventajoso dejar que algunos de los componentes de la mezcla de alimentación, por ejemplo componentes que no tienen una afinidad significativa por la fase estacionaria, pasen a través de la columna con el disolvente portador; en este caso sólo los componentes de la alimentación retenidos serán resueltos por cromatografía de desplazamiento.

Una vez que la muestra se ha cargado en la columna, se introduce en la columna una solución que contiene un compuesto desplazador en un disolvente adecuado para hacerla pasar a través de la fase estacionaria. El compuesto desplazador se elige de manera que tenga una afinidad más alta por la fase estacionaria que cualquiera de los componentes de la mezcla de alimentación. Suponiendo que el desplazador y la fase móvil se han elegido de forma apropiada, los componentes individuales salen de la columna como zonas adyacentes de material relativamente puro altamente concentrado, por orden de afinidad de absorción creciente. Después de las zonas de los componentes individuales purificados, el desplazador emerge de la columna. Un cromatograma de desplazamiento se distingue fácilmente de un cromatograma de elución por el hecho de que el compuesto desplazador sigue a la muestra y que los componentes de la alimentación salen de la columna como zonas adyacentes de material relativamente puro de alta concentración.

La cromatografía de desplazamiento tiene algunas características particularmente ventajosas para la cromatografía a escala de proceso. En primer lugar, la cromatografía de desplazamiento puede lograr la separación del producto y la concentración en una sola etapa. A título comparativo, la cromatografía de elución isocrática tiene como resultado una dilución de producto significativa durante la separación. En segundo lugar, dado que el proceso de desplazamiento funciona en la región no lineal de la isoterma de equilibrio, son posibles cargas elevadas de la columna. Esto permite una utilización mucho mejor que la columna de cromatografía de elución. En tercer lugar, el desarrollo de la columna y la separación de los componentes requieren menos disolvente que un proceso de elución comparable. En cuarto lugar, la cromatografía de desplazamiento puede concentrar y purificar componentes de las mezclas que tienen factores de separación bajos, mientras que en la cromatografía de elución típica se requieren factores de separación relativamente grandes para una resolución satisfactoria.

Con todas estas ventajas, se podría suponer que la cromatografía de desplazamiento se utiliza ampliamente. Sin embargo, siguen existiendo problemas en la cromatografía de desplazamiento. Uno de tales problemas es la necesidad de regenerar la columna, ya que no sería económico desechar la fase estacionaria después de cada uso. Otro problema de estos es la obtención de compuestos desplazadores adecuados que sean compuestos relativamente simples, fáciles de sintetizar y/o disponibles en el mercado a un coste razonable (económico) . Estos dos problemas han presentado inconvenientes significativos a la cromatografía de desplazamiento frente a la cromatografía de elución.

Con respecto a la regeneración, dado que el proceso de desplazamiento utiliza un compuesto desplazador que tiene una afinidad muy alta por la fase estacionaria, el tiempo que se necesita para regenerar y reequilibrar la columna puede ser largo en comparación con la cromatografía de elución. Además, a menudo se requieren cantidades de disolvente relativamente grandes durante la regeneración. Estos problemas han reducido efectivamente las ventajas de la cromatografía de desplazamiento sobre la cromatografía de elución.

El segundo problema, el de la obtención de compuestos desplazadores útiles que puedan ser sintetizados con relativa facilidad y/o que estén disponibles comercialmente a un coste razonable (económico) , es debido a la necesidad de un compuesto desplazador que tenga una alta afinidad por la fase estacionaria pero que también pueda ser retirado de la columna durante la regeneración con relativa facilidad. Tales compuestos que han sido ofrecidos por la técnica anterior no cumplen con uno o con ninguno de estos dos importantes criterios. Varios compuestos han sido ofrecidos como desplazadores de bajo peso molecular, pero estos han sido muy difíciles de sintetizar y purificar, y no han estado comercialmente disponibles a un costo razonable, o simplemente no están disponibles... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cromatografía de desplazamiento, que comprende: cargar en una fase estacionaria que comprende un material de intercambio aniónico una mezcla que comprende uno

o más componentes a separar; 5 desplazar al menos uno del uno o más componentes de la fase estacionaria aplicando a la fase estacionaria una mezcla que comprende un compuesto desplazador polianiónico poliaromático que tiene la fórmula general:

Cen (Ar) w en la que Cen = un anillo de benceno, un bifenileno, un naftileno, en la que :

w = 2 al mayor número de posiciones sustituibles en Cen; y Ar = (a) , (b) y/o (c) ; y en donde, en los siguientes (a) , (b) y (c) : An− = independientemente, sulfonato, carboxilato, fosfonato, fosfinato, fosfato, un fosfato mono- o di-éster, sulfato,

un sulfato mono-éster; o boronato; G = independientemente H, alquilo C1 - C6, alquenilo C1 - C6, arilo C6 – C10, halógeno, nitro, hidroxi, alcoxi C1 - C6, 15 ciano, -NH2, -NRH, -NR2, -NHC (O) R, -CHO, -C (O) R; y (a) , (b) y (c) son:

(a)

en donde en (a) 20 x = 2 o 3

y = 3 o 2

x + y = 5; y/o (b)

o

(c)

en donde en (c)

x = 1 -3

y = 1 -3

x + y = 4.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el uno o más componentes comprenden uno o más polipéptidos naturales o recombinantes, una o más proteínas naturales o recombinantes, uno o más oligonucleótidos naturales o recombinantes, uno o más DNA naturales o recombinantes, uno o más RNA naturales o recombinantes,

o una mezcla de dos o más cualquiera de los mismos.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el componente de la mezcla es desplazado de la fase estacionaria en una fracción en la cual el componente está sustancialmente enriquecido y/o en la cual el componente es sustancialmente separado de los otros componentes de la mezcla.

4. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la mezcla comprende al menos dos componentes a separar o el al menos un componente y al menos una impureza.

5. El procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además detectar uno o más del componente y el compuesto desplazador a medida que emerge de la fase estacionaria, en donde la detección es por uno o más procedimientos entre espectroscopia de absorción en UV/visible, espectroscopia de emisión de fluorescencia, espectrometría de masas, pH, conductividad y uno o más métodos electroquímicos.

6. El procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además regenerar la fase estacionaria, en donde la regeneración comprende (a) tratar la fase estacionaria con una solución de uno o más compuestos entre un hidróxido de metal alcalino, una sal de metal alcalino, un hidróxido alcalino térreo, una sal alcalino térrea, un ácido orgánico, un ácido alquilsulfónico, un hidróxido de amonio cuaternario, una sal de amonio cuaternario, una sal de alquilamina, en donde la solución puede comprender además un tampón de pH adecuado o (b) tratar la fase estacionaria con una solución que comprende agua y un co-disolvente orgánico.

7. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que el compuesto desplazador polianiónico poliaromático tiene la fórmula (V) :

en la que en (V) , cada An~, cada G, cada x y cada y se pueden elegir independientemente y se definen como en la reivindicación 1.

8. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que el compuesto desplazador polianiónico poliaromático tiene la fórmula (VI) :

en la que en (VI) , cada An~, cada G, cada x y cada y se pueden elegir independientemente y se definen como en la reivindicación 1.

9. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la mezcla comprende: 10 (a) uno o más anticuerpos, naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales anticuerpos;

(b) una o más enzimas, naturales o recombinantes, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales enzimas;

(c) una o más proteínas y/o polipéptidos, naturales o recombinantes, para uso diagnóstico, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(d) una o más proteínas y/o polipéptidos, naturales o recombinantes, para uso terapéutico humano o veterinario, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(e) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más, natural o recombinante, plasma sanguíneo animal o humano, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(f) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más, natural o recombinante, material vegetal o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(g) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más de leche animal o humana o leche derivada de un animal recombinante, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(h) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más, natural o recombinante, huevos aviares, o una 10 mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos;

(i) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más, natural o recombinante, bacterias, levaduras, hongos, virus o insectos, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos.

(j) una o más proteínas o polipéptidos derivados de uno o más, natural o recombinante, cultivos de células de mamíferos o tejido animal, o una mezcla de dos o más cualquiera de tales proteínas y/o polipéptidos; o

(k) uno o más compuestos orgánicos, fármacos o productos intermedios de fármacos, o una mezcla de dos o más cualquiera de los mismos.

10. El procedimiento según la reivindicación 9 en el que en (k) uno o más del uno o más compuestos orgánicos, fármacos o productos intermedios de fármacos, son quirales.