Un proceso para preparar una composición liofilizada que comprende una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana,

y al menos un estabilizante seleccionado entre el grupo constituido por un hidrolizado de proteína, leucina y un polisacárido, que comprende (1) una etapa de mezclar una suspensión de la envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana y el estabilizante y (2) una etapa de liofilizar la mezcla obtenida en la etapa (1), en la que (a) la concentración del hidrolizado de proteína, o leucina en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,1 al 2,5% y (b) la concentración del polisacárido en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,05 al 0,5%

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a una composición liofilizada usada para la introducción de ácido nucleico, proteína o fármacos en células y organismos vivos, a un proceso para su producción y a su uso. 5

TÉCNICA ANTECEDENTE

En los últimos años, se han desarrollado diversos sistemas de vectores virales y no virales (sintéticos) para introducir materias extrañas tales como genes en células u organismos vivos. En general, para el suministro intracelular de genes, los sistemas de vectores virales pueden introducir materias extrañas de forma más eficaz que los sistemas de vectores no virales. Sin embargo, los vectores virales pueden haber causado problemas debido a la expresión simultánea de 10 genes esenciales del virus parental, expresión con pérdidas de genes virales, capacidad inmunógena y modificación de la estructura del genoma del huésped. Aunque los vectores no virales son menos citotóxicos e inmunógenos, los sistemas de vectores no virales tienen un problema ya que los vectores no virales no pueden introducir genes de forma tan eficaz como algunos vectores virales, debido a que, en sistemas de vectores no virales, las materias extrañas son captadas por las células por endocitosis. 15

Para superar este problema, se propuso un liposoma que tiene la actividad de fusión de membrana de virus Sendai (virus hemaglutinante de Japón: VHJ) llamado un vector híbrido, es decir un complejo VHJ-liposoma. La actividad de fusión de membrana del virus permite la transferencia de genes intracelulares al interior de células y organismos vivos. Esta técnica se usa frecuentemente en experimentos animales en todo el mundo (documento de patente 1 y documentos no de patente 1 y 2). El VHJ-liposoma se construye fusionando de forma preliminar VHJ inactivado por UV 20 (envuelta de VHJ inactivada) con un liposoma cargado con una proteína, una sustancia química o un gen. Sin embargo, además de la preparación de la envuelta de VHJ inactivada, se requieren etapas engorrosas tales como la preparación del liposoma y el aislamiento del VHJ-liposoma después de la fusión.

Por lo tanto, se propuso la encapsulación directa de genes en una envuelta de VHJ inactivada (documento de patente 2). En este sistema, los genes a introducir en células se encapsulan en una envuelta de VHJ inactivada mediante 25 congelación-descongelación o tratamiento con tensioactivo en presencia del gen, y la envuelta se pone en contacto con las células receptoras para introducir el gen a través de fusión de membrana. Este sistema de transferencia de genes relativamente sencillo usando la envuelta de VHJ inactivada producible en masa se ha usado para la introducción de materias extrañas en células en muchos estudios.

Por otro lado, aunque la envuelta de VHJ inactivada puede crioconservarse (-70ºC) en suspensión sin perder su 30 capacidad de transferir genes, no hay ningún informe sobre su almacenamiento mediante liofilización, presumiblemente debido a que la liofilización arruina la función o la estructura de la envuelta de VHJ inactivada que tiene actividad de fusión de membrana. Sin embargo, se ha demandado una composición liofilizada de la envuelta de VHJ inactivada que pueda almacenarse a temperaturas más altas con vistas al transporte y el almacenamiento.

Documento de Patente 1: Patente de Estados Unidos Nº 5.631.237 35

Documento de Patente 2: WO01/57204

Documento no de Patente 1: Dzau, V. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 93, 11421-11425 (1996)

Documento no de Patente 2: Kaneda, Y. et al. Molecular Medicine Today, 5, 298-303 (1999)

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS QUE PRETENDE RESOLVER LA INVENCIÓN 40

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición liofilizada de una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana que pueda ser almacenada a temperaturas más altas sin perder la capacidad de introducir materias extrañas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para introducir una materia extraña en una célula con alta eficacia.

MANERAS DE RESOLVER LOS PROBLEMAS 45

Los inventores de la presente invención realizaron exhaustivos estudios en busca de maneras de liofilizar la envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana y, como resultado, descubrieron que la adición de hidrolizados de proteínas y algunos aminoácidos ayuda a que la envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana conserve su capacidad de introducir materias extrañas. Además, también descubrieron que la disminución de sales es eficaz para conservar la capacidad de la envuelta viral inactivada de introducir materias 50 extrañas en las células. La presente invención se ha realizado en base a estos descubrimientos. También descubrieron que estos tratamientos impiden de forma eficaz la pérdida de la actividad de fusión de membrana de la envuelta viral

inactivada. Además, consiguieron un nuevo método de introducción de materias extrañas usando una composición liofilizada de la envuelta viral inactivada resultante que tiene actividad de fusión de membrana.

Concretamente, la presente invención proporciona:

1. Una composición liofilizada que comprende una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana, y al menos un estabilizante seleccionado entre el grupo constituido por un hidrolizado de proteína, leucina, y un 5 polisacárido.

2. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la envuelta viral inactivada es una envuelta viral inactivada de un virus de Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae y Flaviviridae.

3. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el estabilizante es un hidrolizado de proteína y un polisacárido. 10

4. La composición liofilizada de acuerdo con una cualquiera de 1 a 3, que se prepara mediante un proceso que comprende una etapa (1) de mezclar una suspensión de la envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana y el estabilizante y una etapa (2) de liofilizar la mezcla obtenida en la etapa (1).

5. La composición liofilizada de acuerdo con 4, en la que la concentración de la envuelta viral inactivada en la mezcla obtenida en la etapa (1) es tal que la DO es de 0,1 a 7,0. 15

6. La composición liofilizada de acuerdo con 4 ó 5, en la que la concentración del hidrolizado de proteína, o leucina en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,1 al 2,5%.

7. La composición liofilizada de acuerdo con una cualquiera de 4 a 6, en la que la concentración del polisacárido en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,05 al 0,5%.

8. La composición liofilizada de acuerdo con una cualquiera de 4 a 7, en la que la concentración de sal en la mezcla 20 obtenida en la etapa (1) es, como máximo, de 3 mM.

9. Un método de introducción de una materia extraña en una célula o un organismo vivo, que comprende:

(1) una etapa de rehidratar una composición liofilizada que contiene una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana con una mezcla que comprende la materia extraña y agua, y

(2) una etapa de poner a la composición obtenida en la etapa (1) en contacto con la célula o el organismo vivo. 25

10. El método de introducción de una materia extraña de acuerdo con 9, en el que la composición liofilizada es la composición liofilizada como se define en una cualquiera de 1 a 8.

11. Un método de fusión celular que comprende:

(a) etapa de rehidratar una composición liofilizada que contiene una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana; y 30

(b) etapa de mezclar la composición obtenida en la etapa (a) con una suspensión de células que se van a fusionar.

12. El método de fusión celular de acuerdo con 11, en el que la composición liofilizada es la composición liofilizada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

EFECTOS DE LA INVENCIÓN 35

Las envueltas virales inactivadas que tienen actividad de fusión de membrana descritas hasta la fecha tienen que almacenarse en un congelador (-20ºC), preferiblemente en un congelador ultrafrío (-70ºC o... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para preparar una composición liofilizada que comprende una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana, y al menos un estabilizante seleccionado entre el grupo constituido por un hidrolizado de proteína, leucina y un polisacárido, que comprende

(1) una etapa de mezclar una suspensión de la envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de 5 membrana y el estabilizante y

(2) una etapa de liofilizar la mezcla obtenida en la etapa (1), en la que

(a) la concentración del hidrolizado de proteína, o leucina en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,1 al 2,5% y

(b) la concentración del polisacárido en la mezcla obtenida en la etapa (1) es del 0,05 al 0,5%. 10

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la envuelta viral inactivada es una envuelta viral inactivada de un virus de Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae o Flaviviridae.

3. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el estabilizante es un hidrolizado de proteína y un polisacárido.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de la envuelta viral 15 inactivada en la mezcla obtenida en la etapa (1) corresponde a una DO de 0,1 a 7,0.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de sal en la mezcla obtenida en la etapa (1) es de, como máximo, 3 mM.

6. Una composición liofilizada preparada de acuerdo con el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un método de introducción de una materia extraña en una célula o un organismo vivo, que comprende: 20

(a) una etapa de rehidratar una composición liofilizada, como se define en la reivindicación 6, que contiene una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana con una mezcla que comprende la materia extraña y agua, y

(b) una etapa de poner a la composición obtenida en la etapa (a) en contacto con la célula o el organismo vivo.

8. Un método de fusión celular, que comprende: 25

(i) etapa de rehidratar una composición liofilizada, como se define en la reivindicación 6, que contiene una envuelta viral inactivada que tiene actividad de fusión de membrana; y

(ii) etapa de mezclar la composición obtenida en la etapa (i) con una suspensión de células a fusionar.