Procedimiento in vitro para aumentar la expresión de PDX-1 en las células,

que comprende las etapas de: a. Proporcionar las células, y b. Poner en contacto las células con al menos un agente de remodelación de cromatina, en el que el al menos un agente de remodelación de cromatina aumenta la expresión de PDX-1 en las células.

Agentes de remodelación de cromatina para aumentar la expresión de PDX-1 y promover la diferenciación celular.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para inducir la diferenciación de células. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos in vitro que inducen a las células a diferenciarse en un linaje pancreático o en una célula productora de hormonas pancreáticas o en un linaje de células . La presente invención también proporciona procedimientos y composiciones para usar dichas células en el tratamiento terapéutico de diabetes.

Antecedentes

La pérdida de la función orgánica puede ser el resultado de defectos congénitos, lesión o enfermedad. La diabetes mellitus o diabetes es un ejemplo de una enfermedad que ocasiona pérdida de función orgánica. La mayoría de los casos de diabetes se incluyen en dos tipos clínicos: Tipo 1, también conocido como diabetes de aparición juvenil o diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) ; y Tipo 2, también conocido como diabetes de aparición en adultos. Un procedimiento de tratamiento común de la diabetes de Tipo 1 implica la administración exógena de insulina, típicamente por inyección con una jeringa o una bomba. Este procedimiento no normaliza por completo los niveles de glucemia y a menudo se asocia con un riesgo aumentado de hipoglucemia. Si la función del páncreas pudiese restaurarse o rejuvenecerse mediante transplante o mediante terapias basadas en células, podría conseguirse un control glucémico más eficaz.

Existen muchas terapias de transplante actualmente usadas para tratar la diabetes: Un tratamiento de este tipo implica el transplante de islotes de Langerhans aislados en el paciente diabético. Un reto para el transplante de islotes en seres humanos ha sido la ausencia de suficiente cantidad de islotes para tratar la gran cantidad de pacientes diabéticos.

Las fuentes alternativas de material celular para transplante pueden incluir, por ejemplo, células derivadas de otros tejidos tales como, por ejemplo, vellosidades coriónicas, líquido amniótico o médula ósea. Estos tejidos distintos pueden ser tejidos fetales o embriónicos. Además, las células endocrinas de los islotes de Langerhans, incluyendo las células , se renuevan constantemente mediante procesos de apoptosis y proliferación de nuevas células de islotes (neogénesis) . Así pues, se piensa que el páncreas es una fuente de células no diferenciadas que pueden diferenciarse en células productoras de hormonas pancreáticas.

Sin embargo, un reto de estas estrategias celulares ha sido la capacidad de estas células para diferenciarse en un linaje de células  o en una célula secretora de hormonas pancreáticas. Dicha diferenciación implica cambios en la expresión de genes.

Mecanismo para la diferenciación celular: La expresión de genes es el proceso combinado de la transcripción de un gen en ARNm, el procesamiento de este ARNm y su traducción en proteínas (para genes que codifican proteínas) . Una comparación de los patrones de expresión de genes de células del páncreas, que secretan enzimas y hormonas digestivas, y del hígado, el lugar de transporte de lípidos y transducción de energía, revela diferencias notables en genes que se expresan altamente. Esta diferencia es coherente con las funciones fisiológicas de estos tejidos. Por ejemplo, la expresión del gen de insulina en un mamífero está limitada a las células  del páncreas a través de mecanismos de control mediados en parte por factores de transcripción específicos, incluyendo Mafa y NeuroD. En otras células del cuerpo, las hormonas pancreáticas, tales como, por ejemplo, insulina, así como los otros genes específicos de peptidasa son transcripcionalmente silenciosos.

En el núcleo de las células de animales o plantas el ADN nunca se encuentra como una molécula desnuda. El ADN está siempre empaquetado en cromatina y se encuentra en asociación con proteínas y otras moléculas. Las moléculas incluyen, por ejemplo, proteínas histonas (solubles en soluciones ácidas) , proteínas del GAM (Grupo de Alta Movilidad, solubles en solución salina neutra) , proteínas residuales (solubles en soluciones de urea concentradas) , fosfoproteínas (solubles en soluciones básicas) , especies de ARN (solubles en soluciones de fenol acuosas) y especies de lípidos (solubles en soluciones de metanol-cloroformo) . La cromatina es esa parte del núcleo de la célula que contiene todo el ADN del núcleo en las células de animales o plantas.

La modificación covalente de histonas se ha implicado en la regulación de expresión de genes. La acetilación reversible de proteínas histonas se combina con la metilación de ADN y otras modificaciones para generar un código epigenético de estructura y función de cromatina modificada. Las modificaciones covalentes para histonas pueden incluir acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinización y sumoilación.

El estado de acetilación de histonas y otras proteínas se regula dinámicamente mediante las acciones opuestas de acetiltransferasas y desacetilasas. Las histonas hipoacetiladas promueven la condensación de la cromatina y están asociadas con locus transcripcionalmente silenciosos, en los que el acceso del ADN a factores de transcripción o al aparato transcripcional está limitado. Dichas modificaciones en la cromatina pueden desempeñar una función seminal en la diferenciación tisular determinando el complemento de genes expresados dentro de tipos de células La metilación del ADN en restos de citosina está asociada con silenciamiento génico. El tratamiento con agentes que modifican esta modificación secundaria del ADN para crear sitios desmetilados se correlaciona con transcripción y expresión activa de genes. El fármaco, 5-azacitidina, puede incorporarse al ADN en lugar de citidina. Como consecuencia, la posición 5 se bloquea, conduciendo a la creación y perpetuación de secuencias de ADN desmetiladas. Después del tratamiento con 5-azacitidina, se han descrito cambios en el estado de diferenciación celular; por ejemplo, se ha inducido el desarrollo de miocitos a partir de precursores no miocíticos. También se ha observado que el fármaco activa genes en un cromosoma X silencioso.

Factores que controlan el desarrollo pancreático: La proteína homeodominio PDX-1 (gen-1 Homeobox Pancreático y Duodenal, conocida también como IDX-1, IPF-1, STF-1 o IUF-1) desempeña una función principal en la regulación del desarrollo y función de los islotes pancreáticos. La PDX-1 regula la transcripción de estos genes asociados con identidades de células , incluyendo insulina, glucoquinasa, polipéptido amiloide de los islotes y transportador de glucosa de tipo 2 (TGLU2) .

El documento US20050090465 pone de manifiesto que la expresión ectópica de PDX-1 en hígado y piel induce un fenotipo de células de islotes pancreáticos en células del hígado y de la piel y da como resultado la expresión, producción y procesamiento de hormonas pancreáticas.

El documento US20040002447 proporciona procedimientos para inducir la expresión del gen de insulina en células. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden las etapas de: (i) proporcionar una célula que exprese un polinucleótido PDX-1; y (ii) poner en contacto la célula con un inhibidor de histona desacetilasa, induciendo por lo tanto la expresión del gen insulina en la células.

Los procedimientos desvelados en los documentos US20050090465 y US20040002447 precisan la expresión ectópica de PDX-1 para inducir la expresión del gen de insulina en células. Por tanto, sigue existiendo una necesidad significativa de desarrollar procedimientos para generar células secretoras de hormonas pancreáticas a partir de una fuente de células abundante que no precise la expresión ectópica de PDX-1.

Sumario

La presente invención incluye procedimientos in vitro que promueven la diferenciación de células modificando la expresión de genes dentro de las células. En una realización, los genes pueden ser necesarios para la diferenciación de un tipo de célula deseado. Como alternativa, los genes pueden asociarse con la función de un tipo de célula deseado. En una realización, puede modificarse la expresión de genes necesarios para la diferenciación y la función de un tipo de célula deseado.

Las células que se diferencian pueden ser en sí mismas células totalmente diferenciadas de otro linaje o tipo de célula o pueden ser células progenitoras... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones

1. Procedimiento in vitro para aumentar la expresión de PDX-1 en las células, que comprende las etapas de:

a. Proporcionar las células, y

b. Poner en contacto las células con al menos un agente de remodelación de cromatina, en el que el al menos un agente de remodelación de cromatina aumenta la expresión de PDX-1 en las células.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en una célula no diferenciada, una célula parcialmente diferenciada, una célula totalmente diferenciada, una célula madre y una célula progenitora.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que antes del tratamiento con el al menos un agente de remodelación de cromatina las células no expresaban PDX-1.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tratamiento de al menos un agente de remodelación de cromatina restablece la expresión de PDX-1.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos un agente de remodelación de cromatina es un inhibidor de la actividad histona desacetilasa.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en butiratos, ácidos hidroxámicos, péptidos cíclicos y benzamidas.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en ácido valproico, 4-fenilbutirato, butirato de sodio, tricostatina A, ácido suberoil anilida hidroxámico (SAHA) , oxamflatina, trapoxina B, FR901228, apicidina, clamidocina, depuecina, escriptaida, depsipéptido y N-acetildinalina.

8. Un procedimiento in vitro para promover la diferenciación de células en una célula progenitora pancreática, que comprende las etapas de:

a. Proporcionar células que no expresen PDX-1, y

b. Poner en contacto las células con al menos un agente de remodelación de cromatina, en el que el al menos un agente de remodelación de cromatina aumente la expresión de PDX-1.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el tratamiento de las células con el al menos un agente de remodelación de cromatina produce el aumento en la expresión de al menos uno de los genes de HNF-3 beta o Sox

17.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en una célula no diferenciada, una célula parcialmente diferenciada, una célula totalmente diferenciada, una célula madre y una célula progenitora.

11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que antes del tratamiento con el al menos un agente de remodelación de cromatina las células no expresaban PDX-1.

12. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el tratamiento de al menos un agente de remodelación de cromatina restablece la expresión de PDX-1.

13. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el al menos un agente de remodelación de cromatina es un inhibidor de la actividad histona desacetilasa.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en butiratos, ácidos hidroxámicos, péptidos cíclicos y benzamidas.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en ácido valproico, 4-fenilbutirato, butirato de sodio, tricostatina A, ácido suberoil anilida hidroxámico (SAHA) , oxamflatina, trapoxina B, FR901228, apicidina, clamidocina, depuecina, escriptaida, depsipéptido y N-acetildinalina.

16. Un procedimiento in vitro para promover la diferenciación de células en una célula secretora de hormonas pancreáticas, que comprende las etapas de:

a. Proporcionar células que no expresen PDX-1, y

b. Poner en contacto las células con al menos un agente de remodelación de cromatina, en el que el agente de remodelación de cromatina aumente la expresión de PDX-1.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el tratamiento de las células con el al menos un agente de remodelación de cromatina provoca aumentos en la expresión de al menos uno de los genes de HNF-3 beta, Sox17, insulina, glucagón o somatostatina.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en una célula no diferenciada, una célula parcialmente diferenciada, una célula totalmente diferenciada, una célula madre y una célula progenitora.

19. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que antes del tratamiento con el al menos un agente de 5 remodelación de cromatina las células no expresaban PDX-1.

20. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el tratamiento de al menos un agente de remodelación de cromatina restablece la expresión de PDX-1.

21. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el al menos un agente de remodelación de cromatina es un inhibidor de la actividad de histona desacetilasa.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en butiratos, ácidos hidroxámicos, péptidos cíclicos y benzamidas.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en ácido valproico, 4-fenilbutirato, butirato de sodio, tricostatina A, ácido suberoil anilida hidroxámico (SAHA) , oxamflatina, trapoxina B, FR901228, apicidina, clamidocina, depuecina, escriptaida, depsipéptido y N-acetildinalina.