VECTORES LENTIVIRALES PARA LA PREPARACION DE COMPOSICIONES INMUNOTERAPEUTICAS.

Composición inmunógena que comprende un vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS),

capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de VIH y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células, cuando se administra a un paciente

Vectores lentivirales para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas.

La presente invención se refiere al uso de vectores retrovirales, y especialmente a vectores lentivirales para la preparación de composiciones que son capaces de inducir o contribuir a que tenga lugar o la mejora de una reacción inmunológica in vitro, y en una realización preferida in vivo, frente a epítopos que son codificados por secuencias de nucleótidos presentes en los vectores.

Los inventores han mostrado que los vectores preparados según la presente invención permiten obtener una respuesta inmune mediada por células, especialmente una reacción de linfocitos T citotóxicos (LTC) frente a epítopos.

Además han obtenido datos que muestran que esta respuesta inmune mediada por células puede ser una respuesta específica, obtenida frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de nucleótidos contenidos en los vectores.

Por tanto, la invención proporciona medios que podrían utilizarse en protocolos de tratamiento frente a tumores y cáncer y especialmente podrían utilizarse en protocolos para inmunoterapia o terapia de vacunación frente a tumores

También la invención da a conocer medios que podrían utilizarse para el tratamiento o profilaxis de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con infección por virus y por ejemplo, con infección por retrovirus.

Los inventores además han obtenido resultados que muestran que la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta LTC asociada con el tratamiento mediante las composiciones de la invención puede ser específica para el antígeno del tumor o del virus o células infectadas por el virus, y también puede limitarse a moléculas específicas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad).

Particularmente la invención se refiere al uso de los vectores en composiciones inmunógenas, con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células limitada a las moléculas de clase I del complejo CMH y por ejemplo limitada a moléculas HLA-A2 o B7.

En consecuencia, la invención se refiere a una composición inmunógena que comprende un vector recombinante que comprende un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS). Durante la transcripción inversa, las secuencias cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN de tres cadenas denominada aquí en el presente documento como ADN tricatenario. El ADN tricatenario estimula la importación nuclear del genoma del ADN del vector, siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés) y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que la composición es capaz de inducir o estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o de CD4 frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.

En una realización preferida de la invención, la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta de LTC o la respuesta de CD4 frente a uno o varios epítopos es una respuesta de LTC o de CD4 de memoria.

Se enfatiza que la presencia, en el vector, de las regiones cPPT y CTS permiten que de ese modo se forme una estructura de ADN tricatenario influyendo y especialmente mejorando la importación nuclear del genoma del vector en células recombinadas con dicho vector.

Esta capacidad de la composición inmunógena según la presente invención para inducir, mejorar o en general para asociarse a los acontecimientos de la respuesta de LTC de memoria, permite proponer el uso de la composición inmunógena en los protocolos de terapia antitumoral o terapia antivírica o antipatógena, incluyendo si la respuesta inmune tiene que inducirse en un largo periodo de tiempo o ser al menos inducible cuando se busca una respuesta en un periodo de tiempo que puede ser inducción a largo plazo de la respuesta, tras la administración de la composición inmunógena. En otras palabras, puede usarse la composición inmunógena para la preparación de composición terapéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales o enfermedades infecciosas, por ejemplo mediante bacterias o virus, induciendo o estimulando o participando en la aparición de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una respuesta de LTC o una respuesta de memoria.

Se enfatiza que la composición inmunógena de la invención, como consecuencia de la presencia de la estructura tricatenaria en la secuencia del vector, que resulta de la presencia de las regiones CTS y cPPT en el vector y en las partículas del vector, permiten la estimulación de la importación nuclear del genoma del vector, en células diana. Los epítopos inducidos en el vector pueden ser propios o no.

La presenta invención abarca también el uso de una secuencia nucleotídica que comprende las secuencias CTS y cPPT de origen retroviral o sintético para aumentar la entrada de las secuencias de nucleótidos o de péptidos en el núcleo de las células diana o células receptoras.

Según un ejemplo, se entiende que dicha secuencia tricatenaria comprende secuencias extrañas o secuencias propias con respecto a las células receptoras.

Por tanto, la invención describe una composición que podría utilizarse en protocolos terapéuticos que presentan analogías con los protocolos de vacunación, para el tratamiento de tumores y especialmente como tratamiento de enfermedades antiinfeccioso o anticancerígeno.

Es interesante observar que según la presente invención, este transgén o secuencia de interés puede ser una secuencia que codifica para uno o varios epítopos de una o varias células tumorales, por ejemplo, epítopos que se han identificado en antígenos diana potenciales para la inducción de una respuesta inmune mediada por células frente al tumor.

Varios epítopos que forman un múltiple epítopo, pueden codificarse por el transgén de la invención. En una realización particular, pueden derivarse de los antígenos diana identificados en el tumor, y pueden elegirse de tal manera que cuando su secuencia codificante se combina para formar el transgén, se obtiene una respuesta inmune mediada por células frente a todos los epítopos o frente a la mayoría de ellos. Puede ensayarse la respuesta inmune mediada por células in vitro o en una realización preferida in vivo. Los protocolos que permiten llevar a cabo tales ensayos se describen en los ejemplos.

Se han identificado antígenos diana en varios tipos de tumores y en particular en melanomas o en carcinomas, incluyendo carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón, cáncer de mama, leucemia y linfoma...

Según otro aspecto de la invención, puede utilizarse la composición inmunógena con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células, en enfermedades infecciosas, que incluyendo infección asociada a virus, o infección ligada a cualquier tipo de patógeno, incluyendo Mycobacteria, por ejemplo M. tuberculosis.

En este caso pueden identificarse antígenos específicos capaces de provocar una respuesta inmune mediada por células y pueden insertarse sus secuencias codificantes en el vector utilizado en la composición inmunógena. Puede utilizarse como ejemplo el gen des de M tuberculosis.

Se añade también según la presente invención, que los vectores que se utilizan en las composiciones inmunógenas pueden expresar epítopos o pueden estar presentes en proteínas (incluyendo glucoproteínas u otros compuestos derivados de proteínas) identificadas como antígenos diana en células tumorales o en células infectadas por virus.

Además, se observa que epítopos, polipéptidos o proteínas utilizadas para proporcionar epítopos, pueden modificarse, por ejemplo mediante mutación, deleción o inserción y por ejemplo pueden modificarse para mejorar su estabilidad.

La invención se refiere también a una composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes que comprenden:

        1)        una secuencia de nucleótidos recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos definida (transgén), situada...

1. Composición inmunógena que comprende un vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de VIH y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células, cuando se administra a un paciente.

2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicho uno o varios epítopos de VIH son epítopos de LTC.

3. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones cPPT y CTS es de 178 pb de longitud.

4. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha respuesta mediada por células es una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o una respuesta de CD4.

5. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que la respuesta mediada por células es una respuesta de memoria.

6. Composición inmunógena según la reivindicación 4, en la que la respuesta de LTC generada es una respuesta de LTC de memoria.

7. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque las secuencias de origen retroviral se derivan a partir de un genoma de lentivirus.

8. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque dicha secuencia de transgén está contenida en un casete de expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.

9. Composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes o similares a retrovirales recombinantes que comprende 1) una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de VIH, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y 2) un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral o de un transposón e insertándose en una localización y orientación funcional con señales reguladoras de la retrotranscripción de origen retroviral o similares a retroviral o señales reguladoras de transposones, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o una respuesta de CD4, cuando se administra a un paciente.

10. Composición inmunógena según la reivindicación 9, en la que dichas partículas retrovirales recombinantes comprenden además:

a) un polipéptido gag que corresponde a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),

b) un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),

c) un polipéptido de envoltura o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV),

11. Composición inmunógena según la reivindicación 9, en la que dichas partículas similares a retrovirales recombinantes comprenden:

a) un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, derivándose dicho fragmento de ADN de un retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con señales reguladoras de retrotransposón,

b) un polipéptido que corresponde a las nucleoproteínas de un retrotransposon o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),

c) un polipéptido pol que corresponde a proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposon o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),

d) un polipéptido de envoltura viral,

e) una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de VIH, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotransposón de retrotranscripción, expresión y encapsidación, en la que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta de LTC o una respuesta de CD4, cuando se administra a un paciente.

12. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones cPPT y CTS es de 178 pb de longitud.

13. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que la respuesta de LTC generada es una respuesta de LTC o una respuesta de CD4 de memoria.

14. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación son de origen lentiviral, y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT es de origen lentiviral.

15. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque las señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT, se derivan de un virus seleccionado de los lentivirus CAEV, VAIE, VISNA, VIH, VIS o VIF.

16. Composición inmunógena según la reivindicación 15, caracterizada porque las señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT en el vector, se derivan de un retrovirus de tipo-VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.

17. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque el polinucleótido del vector es una secuencia de ADN que comprende la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación (CTS) de un genoma retroviral de VIH-1.

18. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizada porque las secuencias gag, pol y env de las partículas del vector se derivan de las secuencias de un retrovirus de VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.

19. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizada porque las secuencias gag y pol se derivan de las secuencias de un retrovirus de VIH y la secuencia env se deriva de un retrovirus de VIH diferente o de otro virus.

20. Composición inmunógena según la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia env codifica para polipéptidos ENV anfótropos.

21. Composición inmunógena según la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia env codifica para polipéptidos ENV ecotrópicos.

22. Composición inmunógena según la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia env se deriva de los virus de la estomatitis vesicular (VEV).

23. Transducto de célula con un vector recombinante o partículas recombinantes de una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Célula recombinante según la reivindicación 23, que es una célula que presenta un antígeno o una célula elegida entre células de pulmón, células de cerebro, células epiteliales, astrocitos, microglía, oligodendrocitos, neuronas, células musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales, cepas celulares de la médula, macrófagos, fibroblastos, células hematopoyéticas.

25. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para su uso en el tratamiento de infección por retrovirus.

26. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que la secuencia de transgén codifica para un múltiple epítopo de VIH.

27. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que dicho uno o varios epítopos de VIH se derivan de pol VIH-1 o una región del gen de RT.

28. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que dicho uno o varios epítopos o dicho múltiple epítopo se modifica mediante mutación, deleción o inserción.

29. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que la secuencia de transgén codifica para al menos 2 secuencias diferentes que corresponden a 2 epítopos de patógenos diferentes.

30. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o vector o partícula de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que las regiones CTS y cPPT tienen una localización central en la secuencia del vector.

31. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o vector o partícula de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que dicha secuencia de transgén se inserta en la región U3 de las señales de regulación para la retrotranscripción.

32. Vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de VIH, y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células, cuando se administra a un paciente.

33. Vector recombinante según la reivindicación 32, en el que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones CTS y cPPT es de 178 pb de longitud.

34. Vector recombinante según la reivindicación 32, en el que dicha respuesta mediada por células es una respuesta de LTC o una respuesta de CD4.

35. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en el que dicha secuencia de transgén codifica para un múltiple epítopo de VIH.

36. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que dicho uno o varios epítopos de VIH se derivan de pol VIH-1 o una región del gen de RT.

37. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que dicho uno o varios epítopos o dicho múltiple epítopo se modifica mediante mutación, deleción o inserción.

38. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 que es capaz de inducir o estimular la importación nuclear del genoma del vector en células diana.

39. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37 en una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

40. Vector caracterizado porque es el plásmido pTRIP.ILKE-IRES-GFP, depositado con la CNCM el 11 de octubre de 1999, bajo el número I-2327.