UTILIZACION DE PROTEASAS ASPARTICAS EN EL CAMPO COSMETICO Y TERAPEUTICO.

Composición cosmética o farmacéutica que comprende en un medio fisiológicamente aceptable,

por lo menos un polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica

Utilización de proteasas aspárticas en el campo cosmético y terapéutico.

La presente invención tiene por objeto principal la utilización, en los campos cosmético y terapéutico, de las formas truncadas o derivadas de una proteasa de ácido aspártico denominada SASPasa o de una mezcla de polipéptidos procedente de su proteólisis con vistas a tratar unos trastornos relacionados con una disfunción de la proliferación y/o de la diferenciación celular.

La invención tiene asimismo por objeto unas secuencias de ácido desoxirribonucleico que codifican las formas denominadas activadas de dicha proteasa de ácido aspártico SASPasa, las secuencias polipeptídicas correspondientes y las utilizaciones de dichas secuencias desoxirribonucleicas.

Las proteasas son unas enzimas hidrolíticas capaces de cortar unas uniones peptídicas. Un cierto número de ellas son conocidas en la actualidad por desempeñar una función esencial a nivel del equilibrio y de la fisiología de la epidermis.

La epidermis está dividida convencionalmente en una capa basal de queratinocitos que constituye la capa germinativa de la epidermis, una capa denominada espinosa constituida por varias capas de células poliédricas dispuestas sobre las capas germinativas, una a tres capas denominadas granulosas constituidas por células aplanadas que contienen unas inclusiones citoplásmicas distintas, los granos de queratohialina y por último, un conjunto de capas superiores denominadas capas córneas (o stratum corneum), constituidas por queratinocitos en el estado terminal de su diferenciación denominados corneocitos.

Los corneocitos son unas células anucleadas constituidas principalmente por una materia fibrosa que contiene unas citoqueratinas, rodeada por una envolvente córnea. Existe permanentemente una producción de nuevos queratinocitos para compensar la pérdida en continuo de células epidérmicas a nivel de la capa córnea según un mecanismo denominado descamación. Un desequilibrio entre la producción de las células a nivel de la capa basal y el índice de descamación puede conducir en particular a unas formaciones de escamas en la superficie de la piel.

En este caso, numerosas patologías cutáneas se caracterizan por la producción de una capa córnea gruesa y por una descamación anormal, es decir, por una hiperqueratosis. A título de ejemplo, se pueden citar:

A la inversa, algunas manifestaciones patológicas conllevan un adelgazamiento de la epidermis y más particularmente de la capa córnea. Este tipo de manifestaciones se traduce entonces por una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo. A título representativo de estos trastornos, se pueden citar en particular las reacciones de origen inmunitario inducidas generalmente por la puesta en presencia o el contacto con uno o varios agentes exógenos.

En consecuencia, el conocimiento de los polipéptidos implicados en la cohesión intercorneocitaria es una de las vías que puede permitir la elaboración de productos destinados a luchar contra los efectos de un exceso o de una falta de polipéptido(s) de este tipo, en particular en la superficie de la piel.

Uno de los objetivos de la invención es precisamente proponer la utilización, con un fin cosmético y/o terapéutico, de un polipéptido implicado en la regulación del fenómeno de diferenciación/proliferación epidérmica.

Más precisamente, los inventores han demostrado en unos queratinocitos humanos, han aislado y han purificado un polipéptido que contiene en su secuencia peptídica (SEC ID nº 5), la secuencia FLVDSGAQVSVV (SEC ID nº 1) que corresponde a una firma PROSITE PS00141 de los sitios activos de las proteasas de la familia de las proteasas denominadas de ácido aspártico.

Este polipéptido denominado asimismo a continuación proteína SASPasa, está por otra parte caracterizado por la presencia en su secuencia peptídica de las secuencias siguientes:

De manera inesperada, los inventores han demostrado que la proteína representada por la secuencia SEC ID nº 5, denominada asimismo SASPasa, poseía una actividad proteolítica significativa, y han constatado en particular esta actividad frente a la caseína y la insulina, tal como lo muestran los ejemplos siguientes.

Por otro lado, han observado que esta proteína SASPasa era autocatalítica y generaba a un pH comprendido entre 3 y 7, preferentemente superior o igual a 4,5, una forma truncada denominada "SASPasa activada", que corresponde a la secuencia SEC ID nº 6, capaz a su vez de dimerizarse.

Un aspecto de la invención se refiere por lo tanto a un polipéptido aislado y purificado, que pertenece a la familia de las proteasas de ácido aspártico, caracterizado porque posee una secuencia peptídica representada por la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.

La SEC ID nº 6 corresponde a una forma activada de la SEC ID nº 5.

La SEC ID nº 16 corresponde a la secuencia SEC ID nº 6 delecionada de sus dos primeros aminoácidos.

La secuencia SEC ID nº 25 es otra forma activada de la SEC ID nº 5. Se obtiene a partir de una forma truncada de la SASPasa (SEC ID nº 36) delecionada del sitio que codifica para la secuencia FANS (SEC ID nº 29). Se genera más particularmente a pH 5,00 en tampón acetato.

La secuencia SEC ID nº 27 corresponde a la secuencia SEC ID nº 25 delecionada de una parte de su fragmento C-terminal.

De manera general, la invención se extiende a todas las formas homólogas de los diferentes polipéptidos o secuencias peptídicas citadas. Habitualmente, se entiende por homólogo de un polipéptido o de una secuencia peptídica, cualquier polipéptido o cualquier secuencia peptídica que tiene una homología de secuencia de por lo menos 85%, en particular de por lo menos 90% y en particular de por lo menos 95% y que tiene, llegado el caso, el mismo tipo de actividad biológica que dicho polipéptido o que dicha secuencia peptídica.

Estas formas homólogas engloban las variantes definidas a continuación.

La invención se extiende en particular a las formas homólogas de los polipéptidos citados anteriormente, es decir, que manifiestan la misma actividad biológica y que poseen por lo menos 85%, en particular por lo menos 90% y en particular por lo menos 95% de homología de secuencia con la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.

La invención se extiende asimismo a las proteínas que contienen al mismo tiempo el motivo "aspartyl protease retroviral type" definido con la referencia de motivo PROSITE: PS50175 así como por lo menos un dominio transmembranario tal como se ha predicho por los algoritmos reconocidos para dicha detección entre los cuales se pueden citar: PRED-TMR2, TMHMM, TMpred y SOSUI.

Las modificaciones, denominadas asimismo mutaciones o variaciones, según la invención, se pueden derivar, o bien de la deleción de uno o varios aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, o de la adición de uno o varios aminoácidos a la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27; o bien de la sustitución de uno o varios aminoácidos en la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27. Las secuencias correspondientes son designadas asimismo con el término de variantes en el marco de la presente invención.

A título ilustrativo de las variantes de deleción, se pueden citar más particularmente las secuencias peptídicas siguientes:

La secuencia SEC ID nº 4 que corresponde a la SEC ID nº 5 truncada de su fragmento N-terminal ?1-84.

La secuencia SEC ID nº 7 que corresponde a la secuencia de la parte N-terminal de la proteína SASPasa (SEC ID nº 5). La interacción de este fragmento con un ligando biológico podría ser una etapa importante para la activación de la proteína SASPasa y en particular la generación de su forma activada (SEC ID nº 6).

La secuencia SEC ID nº 8 que corresponde a la secuencia de la parte denominada transmembranaria...

1. Composición cosmética o farmacéutica que comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polipéptido se presenta en una forma multimérica y preferentemente dimérica.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dicho polipéptido ha sufrido una o varias modificaciones post-traduccionales.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho polipéptido se presenta en forma de un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, fusionado con un agente de apuntado hidrófilo o hidrófobo o un precursor de bioconversión.

5. Composición cosmética o farmacéutica que comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27 y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica en asociación con por lo menos otro agente activo destinado a la prevención y/o al tratamiento de las afecciones cutáneas.

6. Procedimiento de tratamiento cosmético destinado a luchar contra los trastornos relacionados con una disfunción de la proliferación y/o de la diferenciación celular, caracterizado porque se aplica sobre la piel, las mucosas y/o las fibras queratínicas una composición cosmética que comprende por lo menos un polipéptido cuya secuencia peptídica es una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.

7. Procedimiento de tratamiento cosmético según la reivindicación 6, caracterizado porque prevé tratar las pieles secas, la hiperqueratosis, la paraqueratosis, los trastornos de la sebogénesis y/o las señales de envejecimiento cutáneo.

8. Utilización de un polipéptido cuya secuencia peptídica es una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de las infecciones dermatológicas.

9. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada porque la composición farmacéutica está destinada a tratar la ictiosis, la psoriasis, el eczema, la rosácea, los líquenes, los pruritos, o cualquier patología que implica una hiperqueratosis, una paraqueratosis o que tiene una componente inflamatoria.

10. Utilización de un polipéptido cuya secuencia peptídica está representada por lo menos por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34 o SEC ID nº 35, para preparar una composición destinada a modular la actividad de la proteasa de ácido aspártico de secuencia SEC ID nº 5.

11. Composición cosmética o farmacéutica, caracterizada porque comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido tal como el definido según las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia sentido, antisentido o antisentido interferencial que corresponde a dicha secuencia nucleotídica.

12. Composición según la reivindicación 11, caracterizada porque dicha secuencia nucleotídica está constituida por la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.

13. Polipéptido aislado y purificado que pertenece a la familia de las proteasas de ácido aspártico, caracterizado porque presenta una secuencia peptídica representada por SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.

14. Polipéptido según la reivindicación 13, caracterizado porque presenta una masa molecular aparente comprendida entre 5 y 30 kD, más particularmente entre 9 y 15 kD, y en particular entre 11 y 14 kD.

15. Polipéptido según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque se presenta en forma multimérica y preferentemente dimérica.

16. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque presenta un punto isoeléctrico teórico comprendido entre 3 y 9.

17. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque es de origen natural y está purificado a partir de tejidos de mamíferos.

18. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque se purifica a partir de piel humana y más particularmente a partir de epidermis humana.

19. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque ha sufrido una o varias modificaciones post-traduccionales.

20. Polipéptido según la reivindicación 13 o una de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque se presenta en forma de un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, fusionado con un agente de apuntado hidrófilo o hidrófobo o un precursor de bioconversión.

21. Fragmento de ácido desoxirribonucleico aislado y purificado que codifica un polipéptido tal como el definido según una de las reivindicaciones 14 a 20.

22. Fragmento de ácido desoxirribonucleico aislado y purificado constituido por la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.

23. Vector de expresión recombinante que contiene la totalidad o parte de la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.

24. Utilización de por lo menos una secuencia de ácido desoxirribonucleico tal como la definida según las reivindicaciones 21 ó 22 para preparar una secuencia de ácido ribonucleico sentido, antisentido o antisentido interferencial.

25. Ácido ribonucleico, sentido, antisentido o antisentido interferencial que corresponde por lo menos a la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.

26. Utilización de por lo menos una secuencia sentido o antisentido tal como la definida según la reivindicación 25 con fines de clonación o de identificación de un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 o de sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.

27. Utilización de por lo menos una secuencia sentido o antisentido tal como la definida en la reivindicación 25 para la preparación de una composición para un método de diagnóstico in vitro en el que se utiliza dicha secuencia para la detección de una síntesis de secuencias nucleicas que codifican para un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 o de sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.