Un procedimiento para la separación de analitos de acuerdo con su peso molecular,

que comprende las etapas de: someter un complejo cargado de dichos analitos a un campo eléctrico usando una matriz que comprende un agente de separación cargado, en el que el agente de separación cargado se distribuye a través de la matriz para crear un gradiente de densidad de carga, separándose de este modo dichos analitos de acuerdo con su carga y peso molecular

Separación de analitos mediante masa molecular y carga.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la separación de analitos mediante la aplicación de campo eléctrico y, más específicamente, a un procedimiento y aparato novedoso para la separación de analitos de acuerdo con su masa molecular y su carga, usando una matriz modificada con un agente de separación cargado.

Antecedentes de la invención

Las técnicas más ampliamente usadas para la separación e identificación de productos bioquímicos y otros analitos implican electroforesis en gel. Las matrices usadas actualmente para electroforesis en gel incluyen poliacrilamida, agarosa, gelatina u otros geles formados de polímeros reticulados o polímeros de cadena larga. En electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), las proteínas cargadas se separan en geles de poliacrilamida basándose en su tamaño (masa molecular) en forma nativa y desnaturalizada. Existen diversos tipos de geles de poliacrilamida, que varían en el grado de reticulación y la naturaleza del tensioactivo de desnaturalización incluido en el gel. El tensioactivo que tiene el uso más extendido es dodecilsulfato sódico (SDS).

El principio de SDS-PAGE se basa en el reconocimiento de que la reacción de proteínas de un intervalo de peso molecular amplio con SDS da como resultado la formación de un complejo con una proporción de masa a carga constante (1,4 g de SDS por 1 g de proteína). El complejo de SDS proteína está cargado negativamente. El depósito de una muestra de proteína desnaturalizada de SDS en un gel de poliacrilamida y la aplicación de un voltaje eléctrico provocará que las proteínas se desplacen en el gel y dará como resultado una separación por tamaño molecular debido a la dependencia del tamaño del coeficiente de fricción del complejo de SDS proteína en el gel para proteínas de tamaños diferentes. Esto da como resultado una dependencia logarítmica de la movilidad el complejo de SDS proteína de la masa de la proteína. Se utilizan geles de diferentes densidades para cubrir intervalos de tamaño molecular específicos. El modo de separación preferido mediante SDS-PAGE se realiza en geles de gradiente en los que la densidad de la poliacrilamida se varía desde la parte superior del gel hasta la parte inferior, típicamente del 4-24% de acrilamida incorporada y posibilita la separación en un intervalo de tamaño amplio.

Otro procedimiento de separación electroforético convencional es el enfoque isoeléctrico (IEF), una técnica especial para separar sustancias anfóteras tales como péptidos y proteínas en un campo eléctrico, a través del cual existe tanto un voltaje como un gradiente de pH, ácido en la región del ánodo y alcalino cerca del cátodo. Cada sustancia en la mezcla migrará hasta una posición en la columna de separación en la que el pH circundante corresponde a su punto isoeléctrico. Allí, en forma zwiteriónica sin carga neta, las moléculas de esa sustancia dejan de moverse en el campo eléctrico. De ese modo, diferentes sustancias anfóteras se enfocan en bandas estacionarias estrechas.

Bjellquist y col. en Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 6 (1982), páginas 317-339, describen una combinación de IEF ("primera dimensión") y SDS-PAGE ("segunda dimensión").

Otro procedimiento usado comúnmente para la separación de proteínas basándose en la carga de la proteína es cromatografía de intercambio iónico (IEC). En IEC, las sustancias cargadas se separan a través de materiales de columna que portan una carga opuesta. Los grupos iónicos de columnas intercambiadoras se unen covalentemente a la matriz de gel y se compensan mediante concentraciones pequeñas de contraiones, que están presentes en el tampón. Cuando una muestra se añade a la columna, tiene lugar un intercambio con los contraiones unidos débilmente. El principio de IEC incluye dos enfoques diferentes: intercambio aniónico e intercambio catiónico de acuerdo con la carga de los ligandos en la resina de intercambio iónico.

Un procedimiento adicional para la separación de proteínas mediante el tamaño de la proteína es cromatografía de exclusión por tamaño. Este procedimiento, también conocido como filtración en gel (GPC) o cromatografía de tamiz molecular, se basa en el tamaño y la forma diferentes de las proteínas. Las proteínas de tamaños diferentes penetran en los poros internos de las perlas hasta grados diferentes. La columna retarda las moléculas de proteína pequeñas mientras que las moléculas grandes pasan a través de la misma más rápidamente.

Otros procedimientos para la separación de proteínas incluyen Electroforesis de Zona Capilar y electrocromatografía.

Aunque estas técnicas de separación se aceptan y utilizan de forma universal, las mismas sufren de varias desventajas y limitaciones. Por ejemplo, las desventajas principales de SDS-PAGE son las limitaciones en la separación de proteínas de masa baja y alta (generalmente <10 kD y >200 kD) y la diferenciación de masa muy baja de proteínas pesadas. Además, el uso de geles de gradiente es complicado y requiere mucho trabajo. Este procedimiento también sufre de precisión baja y repetibilidad baja. Finalmente, el uso de geles de densidad alta puede ralentizar significativamente el procedimiento de separación.

Otras biomoléculas tales como ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN) también se pueden separar mediante electroforesis en gel. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden separar usando geles de agarosa. Las técnicas usadas actualmente para separar ácidos nucleicos sufren de muchas de las desventajas y limitaciones de las técnicas usadas para separar proteínas.

Existe una necesidad no satisfecha en la técnica de procedimientos para la separación de productos bioquímicos tales como proteínas, aminoácidos, ADN, ARN y oligonucleótidos que sean eficaces, rentables y que se puedan utilizar para separar analitos de un amplio intervalo de peso molecular, tamaño y longitud y que se puedan adaptar a gran escala (por ejemplo, purificación) y/o automatizarse.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en un principio novedoso para separar analitos tales como proteínas, péptidos, aminoácidos, ADN, ARN y oligonucleótidos y otras biomoléculas, controlando la movilidad electroforética de los analitos en una matriz (por ejemplo, un gel polimérico, vidrio poroso, otros medios porosos, perlas poliméricas inmovilizadas en compartimentos mediante membranas porosas y líquidos de viscosidad alta inmovilizados en compartimentos mediante membranas porosas) modificada con un agente de separación cargado. La matriz comprende regiones estables distribuidas espacialmente cargadas ordenadas en un orden monótono que conserva secuencia, preferentemente comenzando con regiones de carga baja y regiones de densidad de carga baja y terminando con regiones de carga elevada. El intervalo de densidad de carga en la matriz se solapa con el de un complejo de analito cargado de forma opuesta (por ejemplo, un complejo de proteína desnaturalizada-SDS o un fragmento de ADN o ARN). Cuando se aplica un campo eléctrico externo a una muestra de la mezcla de complejo cargado depositada en el extremo de carga baja de la matriz, el complejo se moverá a través de las diferentes regiones cargadas y ocurrirá el enfoque (inmovilización mediante neutralización de carga) de analitos diferentes en diferentes regiones de carga.

Por el contrario a las técnicas de separación convencionales tales como geles poliméricos, en los que la separación se basa en la dependencia de la velocidad de migración (movilidad) del tamaño y la fricción, el principio de separación de la presente invención se basa en la carga total del complejo de analito desnaturalizado. Ya que el complejo conserva la proporción de carga a masa, la carga total del complejo es directamente proporcional a su peso. En esta situación, en un medio de fricción baja, los analitos se moverán en un campo eléctrico con movilidad inicialmente sólo débilmente dependiente del tamaño y perderán su movilidad sólo cuando alcancen las regiones en las que se neutraliza su carga.

Este principio de neutralización de carga para atrapar especies cargadas específicamente es el principio de funcionamiento de las columnas de intercambio iónico. La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que este concepto se puede aplicar a sistemas de separación convencionales tales como sistemas electroforéticos en gel para generar matrices novedosas para separar proteínas, ADN, ARN y otras biomoléculas...

1. Un procedimiento para la separación de analitos de acuerdo con su peso molecular, que comprende las etapas de:

en el que el agente de separación cargado se distribuye a través de la matriz para crear un gradiente de densidad de carga, separándose de este modo dichos analitos de acuerdo con su carga y peso molecular.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la matriz se selecciona entre el grupo constituido por un gel polimérico, vidrio poroso, líquido de viscosidad alta y perlas poliméricas.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho complejo de analito cargado se forma poniendo en contacto dichos analitos con un agente desnaturalizante cargado.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que

7. Un sistema para la separación de analitos de acuerdo con su peso molecular, que comprende:

8. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7,

9. El sistema de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la matriz se selecciona entre el grupo constituido por un gel polimérico, vidrio poroso de poro abierto, líquido de viscosidad alta, perlas de polímero porosas y gel polimérico poroso.

10. El sistema de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el líquido de viscosidad alta y las perlas de polímero porosas están separados en compartimentos por una membrana porosa.

11. El sistema de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el gel polimérico es un gel de poliacrilamida.

12. El sistema de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos analitos se separan mediante electroforesis.

13. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dichos analitos se seleccionan entre el grupo constituido por aminoácidos, polipéptidos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos tales como ADN, ARN y oligonucleótidos.