Un procedimiento in vitro para identificar combinaciones muy sinérgicas de agentes biológicamente activos,

que comprende:

i. seleccionar una biblioteca de activos potenciales en los que se busca sinergia;

ii. identificar un subconjunto de compuestos S(1) que presenten actividad significativa ensayando cada componente de la biblioteca para su actividad en un Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías, siendo dicho ensayo un ensayo de alto rendimiento que incorpora lo suficiente de un sistema biológico completo de modo que las múltiples vías para las que se busca la sinergia sean activas e interaccionen en el ensayo, y teniendo un rango útil conocido de detectabilidad;

iii. identificar un subconjunto de mezclas binarias denominado S(2) que presenten sinergia, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de S(1) en mezclas binarias con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde la concentración del componente S(1) en la mezcla binaria se ajusta usando un Protocolo de Escala de Componente Único en el que uno o más componentes S(1) identificados en la etapa (ii) se diluyen repetidamente y se vuelven a ensayar en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías y se determina una concentración en la que la actividad en dicho ensayo es ? CMáx,1, donde ? es un factor de escala en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5, y CMáx,1 es la actividad máxima realmente detectable en el extremo superior del rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías;

iv. identificar un subconjunto de mezclas sinérgicas ternarias, S(3), por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas binarias S(2) en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(2) usadas en la mezcla ternaria se ajustan usando un Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar S(2) a un valor ? CMáx,1, donde ? y CMáx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(3) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(3) de esa mezcla; y

v. opcionalmente realizar una o más etapas adicionales para identificar un subconjunto de combinaciones sinérgicas de N componentes, denominado S(N), donde N es un número entero mayor de 3, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas que contienen (N-1) componentes, denominadas S(N-1) e identificadas de una manera análoga a la etapa iv), en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo los componentes que mostraron actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(N-1) usadas en las mezcla de N componentes se ajustan usando el Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar la mezcla S(N-1) a un valor ? CMáx,1, donde ? y CMáx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente, y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(N-1) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(N-1) de esa mezcla

Procedimientos para identificar agentes biológicamente activos y combinaciones sinérgicas.

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/457.859 presentada el 26 de marzo de 2003; la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/457.860 presentada el 26 de marzo de 2003; la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/457.861 presentada el 26 de marzo de 2003; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/483.564 presentada el 28 de junio de 2003.

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para identificar agentes biológicamente activos y combinaciones de dichos agentes activos que actúan de forma sinérgica juntos para crear una respuesta biológica mucho más potente que la que pueda conseguir cualquier agente activo solo.

Técnica antecedente

La sinergia entre agentes biológicamente activos es un fenómeno bien conocido. Habitualmente la sinergia se descubre de forma causal o como resultado de la deducción de que debe tener lugar sinergia a partir de la compresión del proceso biológico. Por ejemplo, se esperaría que la combinación de penicilina con un inhibidor de penicilinasa (la enzima que degrada la penicilina) produjera un mayor rendimiento antibiótico - que de hecho lo hace.

Como ha aumentado el conocimiento científico de la complejidad de los procesos vivos, ha llegado a quedar claro que el grado al que está afectado cualquier punto final biológico único por muchas vías diferentes es mucho mayor que el que se había esperado. En particular, ha llegado a quedar claro que las células de mamífero y otras células tienen una enorme redundancia en sus vías. En ninguna parte a quedado esto más claro que en los resultados de experimentos de eliminación génica en los que la deleción completa de un gen que se cree que tiene una función crítica a menudo resiste sin efecto detectable sobre el organismo.

Una consecuencia de esta complejidad es que muchos efectos finales biológicos deseables pueden conseguirse de forma más fácil interviniendo simultáneamente en varias vías, y/o en múltiples puntos dentro de dichas vías, en lugar de centrándose en el hallazgo de un único agente muy potente para que actúe en un punto central vital dentro de la red de vías.

Un modo particularmente claro para entender este fenómeno es considerar el concepto habitual de la "etapa limitante de la velocidad". Convencionalmente, en biología, se cree que hay una etapa dentro de una vía que es habitualmente limitante de la velocidad, es decir, la inhibición de esa etapa tendrá efecto inmediato sobre la vía completa mientras que la inhibición de otras etapas tendrá poco o ningún efecto. Dichas etapas limitantes de la velocidad son por tanto la diana normal para el desarrollo de fármacos. Considérese, son embargo, lo que sucede en un sistema complejo, muy interconectado de vías. Cuando se inhibe la etapa limitante de la velocidad por un agente activo, otras vías dentro del sistema compensan esa inhibición. En esta nueva configuración "compensada", diferentes vías pueden llegar a ser limitantes de la velocidad y se conseguirá un impacto mucho mayor sobre el sistema global añadiendo un agente que actúe sobre esta nueva etapa limitante de la velocidad que el que se conseguiría inhibiendo adicionalmente la etapa limitante de la velocidad original. Se aplica la misma lógica cuando se añade un tercer agente a la mezcla - es probable que incluso una tercera vía llegue a ser limitante de la velocidad cuando se han inhibido ambas vías limitantes de la velocidad iniciales.

Este paradigma de "múltiple intervención activa" como fuente de sinergia es de relevancia cuando se desea el descubrimiento de agentes biológicamente activos, incluyendo en la industria farmacéutica. El enfoque, sin embargo, es de particular interés en sectores de la industria tales como cosméticos, productos de cuidado personal o suplementos de la dieta donde las normas reguladoras no hacen uso de la dificultad de mezclas complejas de agentes activos. Es de particular importancia en estos sectores el potencial de combinaciones de agentes activos que individualmente son de baja potencia y amplia especificidad que pueden, en combinación, ser muy potentes y muy selectivos. Esta propiedad de una combinación de ser más potente y/o selectiva que lo esperado en base a los componentes individuales se define en este documento como "sinergia", y la mezcla de ingredientes que presenta esta sinergia es lo que se entiende por una mezcla "sinérgica".

Descubrir dichas combinaciones muy eficaces, es decir, mezclas sinérgicas, de agentes activos es, sin embargo, desafiante. La causalidad no es un modo válido ya que la cantidad de combinaciones potenciales de agentes es asombrosamente grande. Por ejemplo, hay trillones de posibles combinaciones de factor 5 de incluso una gana relativamente pequeña de 5000 agentes potenciales.

El ensayo de todas las posibles combinaciones de una biblioteca de agentes químicos es raras veces un modo práctico para hallar sinergias de más de dos componentes. Borisy y col. (documento WO 03/021264) muestran que por el uso de procedimientos de ensayo de rendimiento extremadamente elevado es posible descubrir sinergias de dos componentes a partir de bibliotecas del tamaño más modesto pero no ofrece la manera de manipular la enrome cantidad de posibles combinaciones a partir de bibliotecas más grandes o cuando se usan combinaciones de más de 3 componentes.

Incluso cuando se selecciona una combinación particular de agentes químicos, puede ser desafiante determinar si la combinación es sinérgica. El modo clásico de hacer esto es a través del "procedimiento del tablero de damas" en el que se prepara una matriz en la que cada componente de la combinación se ensaya a un intervalo de concentraciones. Para una única combinación de 5 agentes químicos, cada uno se ensaya a 10 concentraciones, de modo que un tablero de damas de 5 dimensiones implicaría 10⁵ ensayos. Berenbaum (Advances in Cancer Research, vol. 35, pág. 269-335, 1981 y Journal of Infectious Diseases, vol. 137, pág. 122-130, 1978) describe un modo más eficaz para ensayar la sinergia entre múltiples agentes químicos, pero este procedimiento aún requiere aproximadamente 100 ensayos para una única combinación de factor 5 de agentes químicos.

Por tanto, la enorme cantidad de posibles combinaciones, unida a la necesidad de muchos ensayos por combinación, ha hecho hasta ahora que la búsqueda sistemática de sinergias de múltiples agentes químicos sea impracticable.

La otra estrategia de descubrimiento normal para deducir combinaciones potenciales a partir del conocimiento del mecanismo también está limitada en su potencial por las siguientes razones.

Muchos puntos finales de organismos vivos están afectados por múltiples vías. Estas vías a menudo no son conocidas, y incluso cuando lo son, los modos en que las vías interaccionan para producir el efecto final biológico a menudo son desconocidos. Por efecto final biológico se entiende el efecto biológico final que se desea del agente o combinación, por ejemplo, la estimulación del crecimiento del cabello o la ralentización o la reversión del proceso de envejecimiento de la piel. Para complicar más la situación, muchos agentes activos potenciales tiene amplia especificidad (en lenguaje farmacéutico son "fármacos sucios" - como la aspirina) y por lo tanto afectan simultáneamente a múltiples vías. Las herramientas matemáticas y los bancos de datos necesarios para modelar y por tanto comprender dicha complejidad, aún no existen y por tanto raramente puede conseguirse el uso de descubrimiento "basado en el mecanismo" de múltiples sinergias.

Se describió un enfoque útil pero limitado para hallar combinaciones muy sinérgicas de agentes en el documento WO 02/02074. En este caso, se identificaron varias etapas específicas dentro de la vía de metabolismo del retinol, que se predijo, sobre fundamentos teóricos, que actuaban sinérgicamente entre sí. Se identificaron los activos eficaces sobre cada etapa a través de ensayos muy específicos tales como inhibición enzimática y se ensayó la serie más pequeña resultante de compuestos activos en combinaciones de elevado orden. Se hallaron elevados niveles de sinergia. Este enfoque, sin embargo, está limitado a un caso especial en el que la vía de interés está bien comprendida y por tanto puede modelarse de forma teórica.

Por tanto sigue existiendo una necesidad urgente de procedimientos eficaces capaces de descubrir estas múltiples sinergias, particularmente...

1. Un procedimiento in vitro para identificar combinaciones muy sinérgicas de agentes biológicamente activos, que comprende:

i. seleccionar una biblioteca de activos potenciales en los que se busca sinergia;

ii. identificar un subconjunto de compuestos S(1) que presenten actividad significativa ensayando cada componente de la biblioteca para su actividad en un Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías, siendo dicho ensayo un ensayo de alto rendimiento que incorpora lo suficiente de un sistema biológico completo de modo que las múltiples vías para las que se busca la sinergia sean activas e interaccionen en el ensayo, y teniendo un rango útil conocido de detectabilidad;

iii. identificar un subconjunto de mezclas binarias denominado S(2) que presenten sinergia, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de S(1) en mezclas binarias con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde la concentración del componente S(1) en la mezcla binaria se ajusta usando un Protocolo de Escala de Componente Único en el que uno o más componentes S(1) identificados en la etapa (ii) se diluyen repetidamente y se vuelven a ensayar en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías y se determina una concentración en la que la actividad en dicho ensayo es ? C_Máx,1, donde ? es un factor de escala en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5, y C_Máx,1 es la actividad máxima realmente detectable en el extremo superior del rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías;

iv. identificar un subconjunto de mezclas sinérgicas ternarias, S(3), por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas binarias S(2) en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(2) usadas en la mezcla ternaria se ajustan usando un Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar S(2) a un valor ? C_Máx,1, donde ? y C_Máx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(3) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(3) de esa mezcla; y

v. opcionalmente realizar una o más etapas adicionales para identificar un subconjunto de combinaciones sinérgicas de N componentes, denominado S(N), donde N es un número entero mayor de 3, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas que contienen (N-1) componentes, denominadas S(N-1) e identificadas de una manera análoga a la etapa iv), en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo los componentes que mostraron actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(N-1) usadas en las mezcla de N componentes se ajustan usando el Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar la mezcla S(N-1) a un valor ? C_Máx,1, donde ? y C_Máx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente, y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(N-1) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(N-1) de esa mezcla.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los subconjuntos de S(1) a S(N-1) ensayados en combinaciones con miembros de la biblioteca contienen solamente uno o una pequeña cantidad de los componentes.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en le que la biblioteca de activos potenciales comprende activos seleccionados de la lista EINECS europea.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la biblioteca de activos potenciales comprende activos seleccionados del Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association Dictionary of Compounds.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la biblioteca de activos potenciales es un subconjunto del Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association Dictionary of Compounds seleccionado en base a los presentados en ese volumen como que tienen actividad biológica.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la biblioteca de activos potenciales comprende activos seleccionados de al menos de las clases seleccionadas entre el grupo constituido por retinol y sus ésteres, estimuladores de retinol, péptidos cortos con o sin modificación hidrófoba o formación de complejos con cobre, minoxidil, productos naturales que proporcionan actividad hipertensiva, productos naturales que contienen antiandrógenos, y agentes químicos capaces de unirse al receptor de vitamina D.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de crecimiento del cabello.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo del Folículo Capilar Aislado, comprendiendo dicho ensayo una multiplicidad de cultivos de folículos capilares individuales contenidos en un medio de cultivo adecuado en el que dichos folículos se retiran de la dermis seccionada en un estado viable a través de la acción de la colagenasa, y en el que el crecimiento capilar se mide por una técnica de medición de alto rendimiento que no está afectada por la presencia de tejidos contaminantes en el cultivo.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la técnica de medición del crecimiento capilar de alto rendimiento comprende la visualización de un agente fluorescente incorporado en el cabello en crecimiento.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Piel Completa a Baja Temperatura, comprendiendo dicho ensayo una multiplicidad de cultivos miniaturizados de piel mantenida en un medio de cultivo libre de suero a una temperatura por debajo de aproximadamente 30ºC, en el que dicha piel contiene folículos capilares viable intactos por debajo de la glándula sebácea, y en el que el crecimiento capilar se mide por una técnica de medición de alto rendimiento.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la técnica de medición del crecimiento capilar de alto rendimiento comprende la visualización de un agente fluorescente incorporado en el cabello en crecimiento.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto biológico de anti-envejecimiento de la piel.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Histología de Alto Rendimiento, comprendiendo dicho ensayo las etapas de tratar simultáneamente con agentes de ensayo cultivos viables de trozos de epidermis que tienen al menos una parte de su dermis asociada intacta, estando contenidos dichos trozos de epidermis en u ensamblaje de múltiples pocillos, en el que dicho tratamiento está seguido de la impregnación de grandes cantidades de trozos de piel cultivados en un único bloque y el seccionamiento histológico del ensamblaje completo y la histología, histoquímica o inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas en un modo de alto rendimiento.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Histología de Alto Rendimiento de Aplicación Tópica, comprendiendo dicho ensayo un cultivo de una lámina de epidermis viable y dermis asociada, repartido por la aplicación de una película de barrera superficial en un patrón de regiones aisladas a las que pueden aplicarse de forma tópica diferentes muestras de ensayo, seguido, después de dicho tratamiento, por la impregnación de grandes cantidades de trozos de piel cultivados en un único bloque y el seccionamiento histológico del ensamblaje completo y la histología, histoquímica o inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas en un modo de alto rendimiento.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es predictivo de la resolución o prevención del acné.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de P. Acnes de Folículo Estimulado, comprendiendo dicho ensayo un cultivo de P. Acnes dispersado en un análogo sintético de sebo humano y mantenido en un ensamblaje que comprende trozos de tubos de dimensiones similares al conducto sebáceo, estando dicho ensamblaje expuesto a agentes antibacterianos en condiciones reales y en el que el crecimiento de P. Acnes superviviente se mide por una técnica de medición de alto rendimiento.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de Inhibición de la Hipercornificación Inducida por IL1, comprendiendo dicho ensayo un cultivo viable de trozos en miniatura de epidermis con al menos una parte de dermis asociada en un ensamblaje de múltiples pocillos, o un cultivo de una lámina de epidermis viable y dermis asociada, repartido por la aplicación de una película de barrera superficial en un patrón de regiones aisladas a las que pueden aplicarse de forma tópica diferentes muestras de ensayo, en cualquier caso usando un medio de cultivo que contiene un nivel de IL1 suficiente para causar hipercornificación; seguido de la impregnación de grandes cantidades de trozos de piel cultivados en un único bloque y el seccionamiento histológico del ensamblaje completo y la histología, histoquímica o inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas en un modo de alto rendimiento.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de la placa dental.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo de Recrecimiento de Biopelícula de Placa, comprendiendo dicho ensayo el crecimiento de una biopelícula de placa en placas de múltiples pocillos en condiciones de reabastecimiento de medio que simula aproximadamente las condiciones de quimiostato, seguido de la eliminación parcial de la biopelícula usando abrasión mecánica en presencia de los agentes de ensayo y la detección de la velocidad de recrecimiento de la biopelícula, opcionalmente usando un agente de descripción, mediante una detección de imágenes automatizada.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de inhibición o control del crecimiento microbiano.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de la pigmentación cutánea.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control del sebo.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de caspa.

24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que ? es menor o igual a 0,2.

25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que ? es menor o igual a 0,1.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que N es un número entero entre 3 y 10.