Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano, o análogo y/o derivado del mismo, caracterizado porque un residuo de glutamina en una posición que oscila desde 132 hasta 137 de la secuencia de la cadena de polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo está unido covalentemente a un polímero hidrófilo no inmunogénico

Monoconjugados específicos de sitio de G-CSF.

En el presente documento se describen monoconjugados específicos de sitio novedosos del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), con análogos y derivados de los mismos, que estimulan la proliferación y diferenciación de células progenitoras en neutrófilos maduros. Estos conjugados se han obtenido usando transglutaminasa para unir covalentemente y de manera específica de sitio, un polímero hidrófilo, no inmunogénico a un único residuo de glutamina de la secuencia de polipéptido del G-CSF humano nativo y análogos del mismo. Estos derivados monoconjugados específicos de sitio novedosos se recomiendan para uso terapéutico puesto que son estables en disolución y presentan actividad biológica in vitro significativa y una semivida en el torrente sanguíneo más larga, con una actividad farmacológica prolongada en consecuencia, en comparación con la proteína no conjugada.

Antecedentes de la invención

El factor estimulante de colonias de granulocitos humano (h-G-CSF) es una glicoproteína de 20 kDa, producida de manera natural por las células del estroma, macrófagos, fibroblastos y monocitos. Su producción aumenta con la exposición a endotoxinas y durante la infección. El G-CSF actúa en la médula ósea, en la que se une con alta afinidad a los receptores del G-CSF (G-CSFR), expresados en las células precursoras de neutrófilos, mediante la inducción de su proliferación y diferenciación en neutrófilos antiinfecciosos maduros, pero sin efectos hematopoyéticos significativos sobre otras líneas celulares hemáticas.

La principal isoforma del G-CSF nativo es un polipéptido de 174 aminoácidos que tiene cuatro residuos de cisteína empleados en dos enlaces disulfuro, un residuo de cisteína libre en la posición 17 y un sitio de glicosilación en el oxígeno (glicosilación con enlace a O) de la cadena lateral del residuo de treonina en la posición 133. Se ha notificado que aunque la glicosilación no es necesaria para establecer un enlace a receptor eficaz o para la actividad biológica del G-CSF (N.A. Nicola, "Hemopoietic Cell Growth Factors and their Receptors", Ann. Rev. Biochem., 58, 45-77, 1989), la presencia de la cadena O-glicosídica sola mejora la estabilidad física y enzimática del G-CSF (M. Oh-eda et al., "O-linked Sugar Chain of Human Granulocyte Stimulating Factor Protects it against Polymerization and Denaturation Allowing it to Retain its Biological Activity", J. Biol. Chem., 265, 11432-11435, 1990; C.R.D. Carter et al., "Human Serum Inactivates Non-Glycosylated but not Glycosylated Granulocyte Colony Stimulating Factor by a Protease Dependent Mechanism: Significance of Carbohydrates on the Glycosylated Molecule", Biologicals, 32, 37-47, 2004). La producción del G-CSF humano mediante técnicas de ingeniería genética ha conducido al desarrollo de nuevas terapias para tratar varias clases de neutropenia, tanto primaria como secundaria. En particular, los compuestos del G-CSF recombinante se prescriben en el entorno hospitalario para las siguientes terapias:

- acortamiento de neutropenia y fenómenos infecciosos y febriles relacionados, en pacientes de alto riesgo que se están tratando con fármacos antitumorales mielotóxicos o mieloablación seguida por trasplante de médula ósea;
- movilización de células progenitoras de sangre periférica que van a emplearse en el trasplante de células autólogas, en pacientes sometidos a mielosupresión o mieloablación, seguido posiblemente por trasplante de médula ósea;
- tratamiento de pacientes que presentan neutropenia congénita o idiopática, que muestran una grave reducción de la concentración plasmática de neutrófilos, así como infecciones y fiebre;
- tratamiento de neutropenia e infecciones bacterianas, que se desarrollan en pacientes con infección por VIH en estadio tardío.

El interés particular mostrado en el tratamiento de pacientes afectados por diferentes tipos de neutropenia con G-CSF, ha estimulado el desarrollo de compuestos recombinantes, producidos en sistemas celulares tanto de mamífero como bacterianos.

De hecho, al menos tres variantes del G-CSF recombinante se encuentran disponibles en varios países para su uso terapéutico:

- una forma glicosilada, denominada lenograstim, expresada en células de mamífero y modificada mediante ingeniería como una cadena de polipéptido de 174 aminoácidos idéntica a la cadena de polipéptido de la proteína nativa y que incluye un resto de oligosacárido con enlace a O en el residuo de treonina en la posición 133;
- una forma no glicosilada, denominada filgrastim, expresada en células bacterianas como una cadena de polipéptido de 175 aminoácidos idéntica a la proteína nativa excepto por un residuo de metionilo adicional en el extremo N-terminal (met-G-CSF);
- una forma no glicosilada, denominada nartograstim, expresada en células bacterianas como una cadena de polipéptido de 175 aminoácidos (met-G-CSF) que difiere de la cadena de polipéptido de la proteína nativa en el residuo de metionilo adicional en el extremo N-terminal, así como la sustitución de los residuos Thr 2, Leu 4, Gly 5, Pro 6 y Cys 18 por, respectivamente, residuos de Ala, Thr, Tyr, Arg y Ser.

Un límite, bien conocido en la aplicación clínica de los diversos derivados del G-CSF recombinante, es la corta permanencia en circulación en el torrente sanguíneo tras la administración parenteral, con una semivida farmacocinética (t_1/2) de 3-4 horas. Como consecuencia, la dosificación de G-CSF recombinante prescrita, por ejemplo, para reducir el desarrollo de infecciones en pacientes que tienen tumores no mieloides y que se someten a quimioterapia mielosupresora, consiste en la administración diaria de inyecciones subcutáneas de 5 microgramos/kg/día de G-CSF para la duración del ciclo de quimioterapia, lo que asciende a 10-14 inyecciones por ciclo.

El perfil farmacocinético del G-CSF, como con la mayoría de citocinas, está regulado por un mecanismo de aclaramiento renal no específico y no saturable (y, en un menor grado, aclaramiento hepático), además de un mecanismo específico y saturable de internalización y degradación parcial mediado por células que expresan el receptor de G-CSF.

Puesto que el aclaramiento renal está relacionado con el tamaño de la molécula de proteína, una manera de reducir la ultrafiltración renal consiste en aumentar el tamaño molecular y/o el volumen hidrodinámico.

Este es un problema muy común en el campo de las proteínas terapéuticas y se han propuesto varias soluciones, tales como la fusión de la proteína terapéutica con proteínas transportadoras (por ejemplo, inmunoglobulinas o albúmina); la incorporación del principio activo en nano y microesferas de polímero de liberación retardada; y la conjugación de proteínas mediante enlace covalente con polímeros de alto peso molecular, biocompatibles.

En particular, en el área de la conjugación covalente de proteína-polímero, se ha empleado extensamente la denominada reacción de pegilación, en la que se une covalentemente la proteína elegida a una o más cadenas de poli(etilenglicol) (PEG) lineales o ramificadas, que tienen un peso molecular que oscila desde 1.000-2.000 Da hasta 20.000-40.000 Da o incluso superior. En general, las proteínas pegiladas muestran menores tasas de aclaramiento renal, así como mayor estabilidad e inmunogenicidad reducida. Cuando PEG se une adecuadamente a un polipéptido, se modifican su volumen hidrodinámico y sus propiedades físico-químicas, mientras que las funciones biológicas fundamentales, tales como actividad in vitro o reconocimiento de receptores, pueden permanecer sin cambios, experimentar una ligera reducción o, en algunos casos, suprimirse por completo. La conjugación con PEG enmascara la superficie de la proteína y aumenta su tamaño molecular, de ese modo disminuyendo la ultrafiltración renal, impidiendo la unión de anticuerpos o células procesadoras de antígenos y reduciendo la degradación por enzimas proteolíticas. Finalmente, la conjugación con PEG confiere las propiedades físico-químicas de PEG y, por tanto, se modifican de manera similar la biodistribución y solubilidad de fármacos peptídicos y no peptídicos. Como alternativa a PEG para la conjugación de la proteína, pueden emplearse otros polímeros biocompatibles lineales o ramificados, tales...

1. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano, o análogo y/o derivado del mismo, caracterizado porque un residuo de glutamina en una posición que oscila desde 132 hasta 137 de la secuencia de la cadena de polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo está unido covalentemente a un polímero hidrófilo no inmunogénico.

2. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano según la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo de glutamina está en una posición que oscila desde 132 hasta 134 de la cadena de polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo o en una posición que oscila desde 133 hasta 135 de la cadena de polipéptido del derivado Met-G-CSF de 175 aminoácidos o en una posición correspondiente de una cadena de polipéptido homóloga del G-CSF.

3. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano según la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo de glutamina está en la posición 134 de la cadena de polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo o en la posición 135 de la cadena de polipéptido del derivado Met-G-CSF de 175 aminoácidos o en una posición correspondiente de una cadena de polipéptido homóloga del G-CSF.

4. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero hidrófilo de conjugación está funcionalizado con al menos un grupo amino.

5. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero hidrófilo se selecciona entre polietilenglicoles, polioxipropilenos, copolímeros de bloque polioxietileno-polioxipropileno, polivinilpirrolidonas, poliacriloilmorfolinas, polisacáridos, polietilenglicoles de aminocarbamilo lineales o ramificados.

6. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero hidrófilo es una monometoxi-polietilenglicol-amina lineal o ramificada que tiene un peso molecular que oscila desde 5 kDa hasta 40 kDa, preferiblemente desde 15 kDa hasta 25 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 20 kDa.

7. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero hidrófilo es un aminocarbamil-polietilenglicol que tiene un peso molecular que oscila desde 5 kDa hasta 40 kDa, preferiblemente desde 15 kDa hasta 25 kDa.

8. Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano según la reivindicación 1, caracterizado por tener una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 2.

9. Formulación que contiene al menos un derivado monoconjugado específico de sitio del G-CSF humano y/o un análogo y/o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, junto con coadyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

10. Formulación según la reivindicación 9, caracterizada por estar en disolución o como polvo liofilizado.

11. Formulación según la reivindicación 9, caracterizada por poder administrarse por vía parenteral.

12. Uso de al menos un derivado monoconjugado específico de sitio según las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de una formulación farmacéutica para tratar y/o prevenir la neutropenia y/o para movilizar células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica de mamífero.

13. Procedimiento para la preparación de un derivado monoconjugado, específico de sitio según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende conseguir una reacción de enlace amida entre el residuo de glutamina y el polímero hidrófilo no inmunogénico en presencia de una enzima de actividad transglutaminasa.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha enzima es de origen bacteriano.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha enzima es la transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo en una solución salina tamponada a un pH que oscila entre 6 y 8, preferiblemente a aproximadamente 7,4.

17. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo durante 1 - 24 horas.

18. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha enzima se usa en cantidades que varían entre 1 y 300 mU/mg de G-CSF o análogo y/o derivado del mismo, preferiblemente en cantidades de aproximadamente 250 mU/mg, y porque dicha reacción se lleva a cabo durante 1 - 6 horas.

19. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha enzima se usa en cantidades que varían entre 1 y 20 mU/mg de G-CSF o análogo y/o derivado del mismo, preferiblemente en cantidades de aproximadamente 10 mU/mg, y porque dicha reacción se lleva a cabo durante 12 - 24 horas.

20. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo a una temperatura que oscila desde 15 hasta 35ºC, preferiblemente a aproximadamente 25ºC.

21. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo en presencia de sales inorgánicas u orgánicas y/o en presencia de tensioactivos.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque dichas sales inorgánicas y/u orgánicas están presentes en una concentración que varía entre 0 y 200 mM y dichos tensioactivos están presentes en una concentración que varía entre el 0 y el 2%.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque dicha sal inorgánica es NaCl.

24. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha enzima y/o dicho G-CSF o un análogo y/o derivado del mismo son de origen recombinante.