METODO PARA MEJORAR LAS INTERACCIONES DE UNION ENTRE MIEMBROS DE PARES DE UNION ESPECIFICOS.

Un método para mejorar las interacciones de unión entre un primer y segundo miembro de un par de unión específico en un medio de soporte que contiene un analito diana,

en el que tanto dicho primer como dicho segundo miembro son móviles y en el que dicho primer miembro del par de unión específico está provisto de una partícula magnética coloidal y dicho segundo miembro del par de unión específico es un determinante en los analitos diana, comprendiendo dicho método provocar que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva con respecto a dicho segundo miembro de dicho par de unión específico por dicho medio de soporte; y separar dicho par de unión específico de dicho medio de soporte

Métodos para mejorar las interacciones de unión entre miembros de pares de unión específicos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los campos de las interacciones de pares de unión específicos, separaciones de bioentidad y al aislamiento de sustancias infrecuentes de líquidos biológicos. Se proporcionan métodos para mejorar tales bioseparaciones, preferiblemente mediante carga magnética mejorada en entidades diana, facilitando de este modo el análisis bioquímico y de diagnóstico de las entidades diana aisladas de este modo.

Antecedentes de la invención

Existen varios procesos y procedimientos sustanciales de fabricación, analíticos y de laboratorio que implican interacciones de pares de unión específicos. Muchos procedimientos de laboratorio y clínicos se basan en tales interacciones, denominadas reacciones de afinidad bio-específicas. Tales reacciones se utilizan de forma común en el ensayo de diagnóstico de muestras biológicas o para la separación de una amplia variedad de sustancias diana, especialmente entidades biológicas tales como células, virus, proteínas, ácidos nucleicos y similares. Es importante en la práctica realizar las interacciones de par de unión específico tan rápida y eficazmente como sea posible. Estas reacciones dependen de consideraciones químicas clásicas tales como temperatura, concentración y afinidad de miembros de pares de unión específicos entre sí. En la situación ideal, se utilizan separaciones que emplean compañeros de unión específicos que forman rápidamente múltiples enlaces no covalentes. El uso de tales compañeros de unión es importante, particularmente cuando la concentración de uno de los miembros del par de unión específico a aislar es extremadamente baja, como es con frecuencia el caso en sistemas biológicos. Por supuesto, las consideraciones de concentración son pertinentes en otros procesos de separación, tales como en purificación de agua, o en aplicaciones donde es necesario eliminar contaminantes traza u otros productos indeseables.

El documento WO 96/07101 describe un procedimiento en el que un miembro de un primer miembro de un par de unión específico se inmoviliza sobre una superficie y se usa un campo magnético para atraer partículas a esa superficie, para promover la unión a un segundo miembro del par de unión específico. El documento WO 96/07101 no describe ni sugiere partículas que se mueven libremente móviles en relación entre sí.

El documento EP 0 295 965 describe un método para detectar un primer miembro de un par de unión específico en una muestra inmovilizando un segundo miembro de unión sobre la superficie de un oscilador de cristal piezoeléctrico, permitiendo que tenga lugar la unión entre el primer y el segundo miembro del par de unión específico y midiendo la diferencia en la frecuencia de oscilación que se produce, como un medio de determinación de la cantidad del primer miembro de unión en una muestra. El documento EP 0 295 965 no describe ni sugiere partículas móviles libremente que se pueden mover en relación entre sí.

El documento EP 1 094 114, que está disponible solamente con propósitos de novedad y en Estados Contratantes solapantes, describe un método para transferir un gen en células diana usando un retrovirus que se une a un vehículo inmovilizado y después se incuba con células diana.

El documento EP 1 094 114 no describe partículas móviles que se mueven libremente en relación entre sí.

Están disponibles diversos métodos para la unión, separación o el análisis de las sustancias diana que se han mencionado anteriormente que se basan en la formación de complejo entre la sustancia de interés y otra sustancia a la que se une específicamente la sustancia diana. La separación de los complejos resultantes de solución o de material no unido se puede conseguir gravitacionalmente, por ejemplo, por depósito o, alternativamente, por centrifugación de partículas finamente divididas o perlas acopladas a la sustancia ligando. Si se desea, tales partículas o perlas se pueden convertir en magnéticas para facilitar la etapa de separación de unido/libre. Las partículas magnéticas se conocen bien en la técnica, al igual que su uso en reacciones inmunes y otras de afinidad bioespecífica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.554.088 y Immunoassays for Clinical Chemistry, págs. 147-162, Hunter et al. eds., Churchill Livingston, Edinborough (1983). Generalmente se puede emplear con este fin cualquier material que facilite la separación magnética o gravitacional. Sin embargo, se prefieren procesos que dependen de principios magnéticos.

Las partículas magnéticas se incluyen generalmente en dos categorías amplias. La primera categoría incluye partículas que se pueden magnetizar permanentemente o son ferromagnéticas; y la segunda comprende partículas que demuestran comportamiento magnético masivo solamente cuando se someten a un campo magnético. Las últimas se denominan partículas que responden magnéticamente. Los materiales que presentan comportamiento que responde magnéticamente se describen en ocasiones como superparamagnéticos. Sin embargo, los materiales muestran propiedades ferromagnéticas masivas, por ejemplo, óxido de hierro magnético, se pueden caracterizar como superparamagnéticos cuando se proporcionan en cristales de aproximadamente 30 nm o menos de diámetro. Los cristales mayores de materiales ferromagnéticos, por el contrario, conservan características de imán permanente después de exposición a un campo magnético y tienden a agregarse después de esto debido a interacción partícula-partícula fuerte.

Las partículas magnéticas se pueden clasificar como grandes (de 1,5 a aproximadamente 50 µm), pequeñas (0,7-1,5 µm) y coloidales o nanopartículas (<200 nm). Las últimas también se denominan ferrofluidos o partículas similares a ferrofluido y tienen muchas de las propiedades de ferrofluidos clásicos. Liberti et al págs. 777-790, E. Pelezzetti (ed) ``Fine Particle Science and Technology, Kluver Acad. Publishers, Netherlands.

La partículas magnéticas pequeñas son bastante útiles en análisis que implica reacciones de afinidad bio-específicas, ya que se recubren de forma conveniente con polímeros biofuncionales (por ejemplo, proteínas), proporcionan áreas superficiales muy grandes y proporcionan una cinética de reacción razonable. Se han descrito partículas magnéticas que varían entre 0,7-1,5 µm en la bibliografía de patentes, incluyendo, a modo de ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 3.970.518; 4.018.886; 4.230.685; 4.267.234; 4.452.773; 4.554.088 y 4.659.678. Se describe que algunas de estas partículas son soportes sólidos útiles para reactivos inmunológicos.

Además de las pequeñas partículas magnéticas que se han mencionado anteriormente, existe una clase de grandes partículas magnéticas (> 1,5 µm a aproximadamente 50 µm), que también tienen comportamiento superparamagnético. Tales materiales incluyen los inventados por Ugelstad (Patente de Estados Unidos Nº 4.654.267) y fabricados por Dynal (Oslo, Noruega). Se sintetizan partículas poliméricas y mediante un proceso de hinchamiento de partículas se incluyen cristales de magnetita en las mismas. Se preparan otros materiales en el mismo intervalo de tamaño realizando la síntesis de la partícula en presencia de cristales de magnetita dispersos. Esto da como resultado la captura de cristales de magnetita haciendo por tanto que los materiales sean magnéticos. En ambos casos, las partículas resultantes tienen comportamiento superparamagnético, que se dispersa rápidamente después de la eliminación del campo magnético. A diferencia de coloides o nanopartículas magnéticas a las que se ha hecho referencia anteriormente, tales materiales, así como pequeñas partículas magnéticas, debido a la masa de material magnético por partícula, se separan de forma sencilla con magnética de laboratorio simple. Por tanto, se realizan separaciones en gradientes de tan sólo unos cientos de gauss/cm, hasta aproximadamente 1,5 kilogauss/cm. Las partículas magnéticas coloidales (inferiores a aproximadamente 200 nm) requieren gradientes magnéticos sustancialmente mayores para la separación debido a su energía de difusión, pequeña masa magnética/partícula y resistencia de stokes.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 de Owen et al. se refiere a partículas superparamagnéticas coloidales recubiertas con polímero, de tamaño submicrométrico. La Patente .698 describe la fabricación de tales partículas por precipitación de una especie magnética...

1. Un método para mejorar las interacciones de unión entre un primer y segundo miembro de un par de unión específico en un medio de soporte que contiene un analito diana, en el que tanto dicho primer como dicho segundo miembro son móviles y en el que dicho primer miembro del par de unión específico está provisto de una partícula magnética coloidal y dicho segundo miembro del par de unión específico es un determinante en los analitos diana, comprendiendo dicho método provocar que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva con respecto a dicho segundo miembro de dicho par de unión específico por dicho medio de soporte; y separar dicho par de unión específico de dicho medio de soporte.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se provoca inicialmente que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva en una dirección y se provoca posteriormente que se mueva en una dirección diferente.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho par de unión específico se selecciona entre el grupo que consiste en biotina-estreptavidina, antígeno-anticuerpo, mimotopo-anticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando, agonista-antagonista, lectina-hidrato de carbono, proteína A-anticuerpo Fc y avidina-biotina.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se provoca que dicha partícula magnética coloidal se mueva a través de dicho medio bajo la influencia de un gradiente de campo magnético.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho analito diana se selecciona entre el grupo que consiste en hormonas, proteínas, péptidos, lectinas, oligonucleótidos, fármacos, sustancias químicas, moléculas de ácido nucleico, células, virus y bacterias.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, en el que dicha partícula magnética coloidal tiene un tamaño de partícula de menos de 200 nm.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, en el que dicho primer miembro es un anticuerpo anti-molécula de adhesión epitelial (anti-EpCAM); y dicho segundo miembro es el antígeno de superficie celular (EpCAM) en dicho analito diana, donde dicho analito diana es una célula tumoral.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo se provoca por fuerzas gravitacionales, de inercia, eléctricas o magnéticas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo está provocado por centrifugación.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo está provocado por separación magnética de alto gradiente.