METODO DE CUANTIFICACION DEL DAÑO O ESTRES OXIDATIVO/NITRATIVO/NITROSATIVO.
Método de cuantificación del daño o estrés oxidativo/nitrativo/nitrosativo.
La presente invención describe un método de cuantificación in vitro del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas, mediante la valoración de la actividad y/o nivel de una enzima SOD recombinante, como consecuencia de la influencia ejercida por dichas especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno sobre la actividad y nivel de dicha enzima
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702035.
Solicitante: UNIVERSIDAD PUBLICA DE NAVARRA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: NAVARRA.
Inventor/es: MORAN JUEZ,JOSE FERNANDO, LARRAINZAR RODRIGUEZ,ESTIBALIZ, RODRIGUEZ URARTE,ESTIBALIZ, AUZMENDI MIGUELENA,IIGO, GONZALEZ GARCIA,ESTHER MARIA, ARRESE-IGOR SANCHEZ,CESAR, ARIZ ARNEDO,IDOIA.
Fecha de Solicitud: 20 de Julio de 2007.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 13 de Enero de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/26 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
Clasificación PCT:
- C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
Fragmento de la descripción:
Método de cuantificación del daño o estrés oxidativo/nitrativo/nitrosativo.
Sector de la técnica
La presente invención se puede englobar dentro del campo de la biotecnología y, por lo tanto, es susceptible de ser aplicada en una gran variedad de sectores de las ciencias de la vida que comprenden la biología, bioquímica, medicina, farmacia y química.
Estado de la técnica
El óxido nítrico (NO) y sus derivados, como el anión peroxinitrito (ONOO-), tienen gran importancia en los sistemas biológicos, ya que pueden mediar en diferentes procesos como son la homeostasis del Fe, la regulación metabólica de genes, desencadenar la defensa patogénica o la inflamación, así como intervenir en diversas enfermedad en animales (Ridnour et al., 2004; Radi et al., 2001; Feelisch et al., 1999; Graziano y Lamattina, 2005).
El peroxinitrito es una especie altamente oxidante asociada al estrés nitrosativo, y que puede oxidar componentes biológicos o causar citotoxicidad. Este agente puede generarse por la reacción del radical superóxido (O2-) con el NO (Feelisch et al., 1995). El peroxinitrito puede ser producido in vitro mediante moléculas como el SIN-1, que genera de manera simultánea cantidades equimolares de NO y O2- (Hogg et al., 1992).
En los sistemas biológicos, la nitración de los residuos del aminoácido tirosina (Tyr) de las proteínas es producida de manera específica por dicho anión (Radi, 2001). El ataque del ONOO- es capaz de provocar la oxidación y la nitración de proteínas tales como la albúmina bovina (BSA) y la superóxido dismutasa (SOD). En la actualidad se conocen muy pocos métodos válidos para detectar especies reactivas de nitrógeno como el peroxinitrito o su precursor el óxido nítrico. El tiempo medio de vida para el NO es de 2 ms en eritrocitos (Thomas et al., 2001), por lo que actualmente se depende de mediciones indirectas para identificar y medir sus niveles. La nitración de tirosinas en las proteínas origina la modificación de los residuos de Tyr a 3-nitroTyr. Un sistema para detectar dicha modificación es la utilización de anticuerpos, policlonales o monoclonales, para detectar 3-nitroTyr (Radi, 2001). Entre las proteínas que pueden ser nitradas en los residuos Tyr produciendo su inactivación se encuentran la Mn-superóxido dismutasa (MnSOD) y la Fe-superóxido dismutasa (FeSOD) (Ischiropoulos, 1992a). La primera se ha asociado con procesos degenerativos renales (Mac Milian-Crow et al., 1996) y con sistemas modelo de macrófagos activados de alveolo de rata (Ischiropoulos, 1992b). También se ha demostrado que la Cu, ZnSOD, otra SOD, es nitrada por el peroxinitrito en las Tyr cercanas a su centro activo (Ischiropoulos, 1992a), lo que también provoca su inactivación.
La detección de actividades SOD ya ha sido medida mediante ensayos espectrofotométricos (Mc Cord y Fridovich, 1969) o mediante ensayos in gel (Beauchamp y Fridovich, 1971). La detección espectrofotométrica de SOD mediante estos dos métodos se basa en la capacidad de la SOD para inhibir la reducción de citocromo c por radical superóxido en un medio de reacción que contiene xantina y xantina oxidasa como generadores de O2-. Sin embargo, nunca se ha utilizado esta técnica para cuantificar cantidades de peroxinitrito usando como diana una SOD recombinante fácil de purificar y producir en grandes cantidades.
La solicitud de patente americana US2006/0211079A1 divulga un método para diagnosticar y pronosticar asma u otras enfermedades cuya etiología está relacionada con la existencia de un alto nivel de estrés oxidativo/nitrosativo. Dicha solicitud de patente americana cita varias especies reactivas de oxígeno/nitrógeno, entre las cuales está el peroxinitrito, capaces de generar enzimas SOD oxidativamente modificadas. Esta solicitud de patente americana expone dos posibilidades para llevar a cabo dicho método: por un lado se realiza una estimación de la reducción de la actividad SOD endógena total y por otro lado se realiza una apreciación de los elevados niveles de alguna de las tres isoformas endógenas de SOD, en su estado oxidativamente modificado, debido a la exposición de dichas isoformas endógenas de SOD a especies reactivas de oxígeno/nitrógeno, como por ejemplo peroxinitrito. Se describe en dicha patente que los niveles de actividad SOD total se deben a la suma de actividades de tres isoformas de SOD endógenas concretas: EC-SOD, Cu ZnSOD y MnSOD. Esta solicitud de patente americana divulga la actividad nitrificante que llevan a cabo las especies reactivas de oxígeno/nitrógeno, como por ejemplo peroxinitrito, a nivel del residuo Tyr de la SOD. Fruto de esa actividad nitrificante, la Tyr se convierte en 3-nitroTyr frente a la cual, debido a la gran afinidad que tienen los anticuerpos, se dirigen anticuerpos monoclonales (anticuerpos anti-nitroTyr) como forma de identificar dicho aumento de los niveles de SOD oxidativamente modificadas.
Además, en el estado de la técnica existen otros documentos relacionados con la presente invención como son:
En todos ellos se divulga el uso del peroxinitrito como promotor de la nitración del residuo Tyr de la SOD y el uso de anticuerpos para detectar SOD una vez expuestas a peroxinitrito, debido a la gran afinidad que tienen los anticuerpos por las formas oxidativamente modificadas de SOD.
Descripción de la invención
La presente invención describe un método, en adelante método de la invención, de cuantificación in vitro del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas, mediante la valoración de la actividad y/o nivel de una enzima SOD recombinante, como consecuencia de la influencia ejercida por dichas especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno sobre la actividad y nivel de dicho enzima.
Tal y como se cita en la presente invención, se muestra como ejemplo de enzima SOD recombinante a la enzima SOD de la planta leguminosa cowpea, Vigna unguiculata, caracterizada por la SEQ ID NO: 1, cuyo gen ha sido donado en un vector de expresión bacteriano y se ha expresado en bacterias de manera recombinante purificándose a homogeneidad.
Tal y como se cita en la presente invención, el daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, se refiere a la presencia de elevadas concentraciones de alguna de las especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno, susceptibles de ser cuantificadas por el método de la invención y comprendidas en el grupo: O2-, NO, ácido hiponitroso (HNO), anión nitrosilo (NO-), nitrito (NO2-), trioxodinitrato (N2O3), catión nitronio (NO2+), radical hidroxilo (OH), radical (hidro) peroxilo (COO), radical alcoxilo (CO), radical carbonato (CO2-), singlete de oxígeno (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), ozono (O3), ONOO-, ácido hipocloroso (HClO), ácido hipobromoso (HBrO), selenito (Na2SeO3), oxígeno (O2), o los precursores de los mismos, así como metales catalíticos que conducen a la...
Reivindicaciones:
1. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno o los precursores de las mismas, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas o sus precursores.
2. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según la reivindicación 1, donde la enzima SOD recombinante está caracterizada por la SEQ ID NO: 1.
3. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la especie reactiva evaluada es el anión peroxinitrito o sus precursores.
4. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la estimación de la concentración de las especies reactivas de oxígeno y/o nitrógeno se realiza mediante la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de dicho enzima recombinante y/o mediante la evaluación del aumento del nivel de dicha enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada.
5. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según la reivindicación 4, donde la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de dicho enzima recombinante se realiza mediante un ensayo de actividad de la enzima recombinante en gel o mediante espectrofotometría o quimioluminiscencia.
6. Uso in vitro de un enzima SOD recombinante para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según la reivindicación 4, donde la evaluación del aumento del nivel de dicho enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada se realiza mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos dirigidos contra residuos Tyr presentes en dicho enzima.
7. Método in vitro, para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno o los precursores de las mismas, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas o sus precursores, mediante la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de una enzima SOD recombinante, y/o la evaluación del aumento del nivel de dicha enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada.
8. Método in vitro, para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según la reivindicación 7, donde la enzima SOD recombinante está caracterizada por la SEQ ID NO: 1.
9. Método in vitro, para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde la especie reactiva de la cual se estima su concentración es el peroxinitrito o sus precursores.
10. Método in vitro, para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de la enzima SOD recombinante, se realiza mediante un ensayo de actividad de la enzima recombinante en gel o mediante espectrofotometría.
11. Método in vitro, para la cuantificación del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la evaluación del aumento del nivel de la enzima SOD recombinante, en su forma oxidativamente modificada, se realiza mediante inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos dirigidos contra residuos Tyr presentes en dicho enzima.
12. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno o los precursores de las mismas, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas o sus precursores, mediante la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de una enzima SOD recombinante, y/o la evaluación del aumento del nivel de dicha enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada.
13. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según la reivindicación 12, donde la enzima SOD recombinante se caracteriza por la SEQ ID NO: 1.
14. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde la especie reactiva de la cual se estima su concentración es el peroxinitrito o sus precursores.
15. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de la enzima SOD recombinante se realiza mediante un ensayo de actividad de la enzima recombinante en gel o mediante espectrofotometría.
16. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la evaluación del aumento del nivel de la enzima SOD, en su forma oxidativamente modificada, se realiza mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos dirigidos contra residuos Tyr presentes en dicha enzima.
17. Kit para la cuantificación in vitro del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno o los precursores de las mismas, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas o sus precursores, mediante la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de una enzima SOD recombinante, y/o la evaluación del aumento del nivel de dicha enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada, que comprende una enzima SOD recombinante.
18. Kit para la cuantificación in vitro del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según la reivindicación 17, donde la enzima SOD recombinante está caracterizada por la SEQ ID NO: 1.
19. Kit para la cuantificación in vitro del daño o estrés oxidativo y/o nitrativo y/o nitrosativo, según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, donde la especie reactiva de la cual se estima su concentración es el peroxinitrito o sus precursores.
20. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo que comprende la evaluación de la capacidad de una célula, grupo de células, tejido u órgano de cualquier organismo vivo para estimular la producción de especies reactivas de Oxígeno y/o Nitrógeno o los precursores de las mismas, y/o la estimación de la concentración de dichas especies reactivas o sus precursores, mediante la evaluación de la disminución de la actividad enzimática de una enzima SOD recombinante, y/o la evaluación del aumento del nivel de dicha enzima recombinante en su forma oxidativamente modificada, que comprende una enzima SOD recombinante.
21. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según la reivindicación 20, donde la enzima SOD recombinante está caracterizada por la SEQ ID NO: 1.
22. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de enfermedades cuya etiología esté relacionada con la existencia de daño o estrés oxidativo y/o nitrativo, según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, donde la especie reactiva de la cual se estima su concentración es el peroxinitrito o sus precursores.
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