Método de cribaje para identificar un candidato a fármaco en el que dicho método comprende los siguientes pasos:

a) obtener una secuencia génica que codifica una aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural;

b) modificar por ingeniería genética el gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa, dando como resultado una aminoacil-tRNA sintetasa con una actividad defectuosa, a condición de que la modificación por ingeniería genética no afecte a la funcionalidad del sitio catalítico de la enzima;

c) clonar el gen resultante del paso (b) en un vector de expresión;

d) transformar células de mamífero aisladas con el vector de expresión resultante del paso (c);

e) cultivar las células recombinantes resultantes del paso (d) en un medio nutriente bajo condiciones que permitan la expresión de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética, dando como resultado muerte celular o una disminución en la tasa de división celular;

f) proporcionar al medio del paso (e) una sustancia a ensayar; y

g) analizar el crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento del crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco

Método de cribaje para la identificación de nuevos inhibidores de la aminoacil-tRNA sintetasa.

La presente invención se refiere a un nuevo método de cribaje que permite la identificación de nuevos fármacos. En particular, la presente invención se refiere a un método de cribaje para la selección de sustancias inhibidoras de aminoacil-tRNA sintetasa que pueden ser útiles como agentes antibacterianos y antifúngicos, entre otros.

Técnica anterior

En los programas modernos de descubrimiento de fármacos, se usan bibliotecas químicas en combinación con sistemas robóticos para evaluar rápidamente el efecto de grandes números de compuestos en una reacción determinada. Este enfoque tiene dos desventajas principales. Primero, a menudo es necesario desarrollar un ensayo bioquímico que pueda ser fácilmente monitorizado para poder identificar compuestos candidatos. Este proceso es costoso y falto de sensibilidad debido a los posibles efectos negativos de los fármacos seleccionados. En segundo lugar, este enfoque ignora los parámetros de biodisponibilidad y toxicidad. De hecho, la mayoría de los compuestos inicialmente seleccionados se descartan más tarde debido a los problemas de solubilidad, biodisponibilidad, o toxicidad.

Las aminoacil-tRNA sintetasas (llamadas en lo sucesivo en este documento "ARS") representan dianas idóneas para el desarrollo de fármacos porque son enzimas esenciales de distribución universal, cuya naturaleza ancestral permite la selección de inhibidores específicos. Además son solubles, estables, fáciles de expresar y purificar en grandes cantidades, y son sencillas de ensayar por uno o varios métodos. Se dispone de estructuras de rayos X para todas las sintetasas, y se conoce mucho acerca del mecanismo de reacción de aminoacilación (consúltese Weygand-Durasevic 1. et al., "Yeast seryl-tRNA synthetase expressed in Escherichia coli recognizes bacterial serine-specific tRNAs in vivo", Eur. J. Biochem., 1993, vol. 214, pp. 869-877).

El código genético se establece en las reacciones de aminoacilación por las ARS, donde cada aminoácido se une a su ARNt afín que lleva el triplete anticodón del código. La tasa de incorporación errónea de aminoácidos en proteínas es muy baja (se estima en un error cada 10⁵ codones) y esta alta precisión se debe en gran medida a la precisión de las reacciones de aminoacilación. La reacción de aminoacilación tiene lugar dentro de un solo dominio de sitio activo y habitualmente sucede en dos pasos. Primero, el aminoácido se activa con ATP para formar aminoacil-adenilato con liberación de pirofosfato. A continuación, el aminoácido se transfiere al extremo 3' del ARNt para generar aminoacil-ARNt y AMP. Esta reacción en dos pasos establece el código genético uniendo tripletes de nucleótidos específicos (anticodones de ARNt) con aminoácidos específicos.

El reconocimiento de los ARNt por las ARS depende principalmente de interacciones moleculares con el brazo aceptor y el bucle del anticodón del ARNt (consúltese Rich, A. "RNA structure and the roots of protein synthesis", Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2001, vol. 66, pp. 1-16). El dominio de sitio activo de las enzimas se une al brazo aceptor de la molécula de ARNt, donde se une el aminoácido. La base "discriminante" (la base no emparejada que precede a la secuencia CCA universal), y los tres primeros pares de bases del brazo aceptor albergan la mayoría de los elementos identificativos reconocidos por los sitios activos de la ARS. Las enzimas usan otros dominios para reconocer la región del anticodón u otras estructuras del ARNt. Estos dominios adicionales no se conservan universalmente y pueden variar de una enzima a otra y de una especie a otra.

Además del reconocimiento de ARNt, las ARS deben diferenciar entre aminoácidos en la mezcla celular. En este sentido, hay 20 ARS, reconociendo cada una un aminoácido específico. Generalmente, los aminoácidos con cadenas laterales que son más voluminosas que las de los aminoácidos afines se excluyen estéricamente de los sitios activos de las ARS, pero los aminoácidos más pequeños pueden encajar en la cavidad del sitio activo y ser activados y cargados erróneamente. Estos adenilatos activados erróneamente o ARNt cargados erróneamente se eliminan normalmente por la función de edición de las ARS. Si no se eliminan, se introduce ambigüedad en el código genético.

Entre los antibióticos comerciales dirigidos a la traducción uno tiene como diana una ARS. El ácido pseudomónico (mupirocina) es un inhibidor de isoleucil-tRNA sintetasas (IleRS) de patógenos infecciosos Gram-positivos. El ácido pseudomónico tiene una selectividad de aproximadamente 8000 veces para IleRS de patógeno frente a IleRS de mamífero, pero la falta de biodisponibilidad sistémica del fármaco limita su uso a aplicaciones tópicas.

Aunque existen otros inhibidores de productos naturales conocidos dirigidos contra sintetasas (por ejemplo, borrelidina, furanomicina, granaticina, etc.), ninguno de éstos se ha desarrollado a antibióticos comerciales debido a la falta de actividad inhibidora, baja especificidad o baja biodisponibilidad. Así pues, se requiere un método más eficiente para seleccionar inhibidores de ARS para explorar grandes bibliotecas químicas e identificar candidatos prometedores de fármacos.

Resumen de la invención

El objetivo de la presente solicitud es proporcionar un método de cribaje para la selección de inhibidores de ARS.

Se proporciona un método de cribaje que supone que el efecto deseado de una sustancia candidata potencial es el rescate y/o la estimulación del crecimiento de células de mamíferos, y no la inhibición de ninguna reacción determinada o la detención del crecimiento del cultivo celular. Así pues, en la selección positiva que se propone aquí, el crecimiento de células de mamíferos se rescata por las sustancias capaces de inhibir la acción tóxica de una ARS diana que se ha obtenido previamente por ingeniería genética. Este efecto puede monitorizarse simplemente midiendo la densidad del cultivo, un procedimiento rápido y barato.

Así pues, un aspecto de la presente invención es la provisión de un método de cribaje para identificar un candidato a fármaco, comprendiendo dicho método los pasos de: a) obtener una secuencia génica que codifica una aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural; b) obtener por ingeniería genética el gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa, dando como resultado una aminoacil-tRNA sintetasa con actividad defectuosa, a condición de que la obtención por ingeniería genética no afecte a la funcionalidad del sitio catalítico de la enzima; c) clonar el gen resultante del paso (b) en un vector de expresión; d) transformar células de mamífero aisladas con el vector de expresión resultante del paso (c); e) dejar crecer las células recombinantes resultantes del paso (d) en un medio nutriente bajo condiciones que permitan la expresión de la aminoacil-tRNA sintetasa obtenida por ingeniería genética, dando como resultado la expresión la muerte celular o una disminución de la tasa de división celular; f) proporcionar una sustancia para ensayar en el medio resultante del paso (e); y g) analizar el crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento del crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la aminoacil-tRNA sintetasa obtenida por inge- niería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco.

De esta forma, usando técnicas de ingeniería genética la enzima pierde la especificidad de unir únicamente al aminoácido afín a su ARNt afín.

Así pues, cuando se produce el ARNt que porta errores de aminoacilación, la proteína modificada se vuelve tóxica para la célula hospedadora de mamífero, dando lugar esta toxicidad a una reducción de la tasa de crecimiento de la división celular o a muerte celular. Cuando se proporciona la sustancia para ensayar a los medios de cultivo celular, puede interactuar con el sitio catalítico de la ARS obtenida por ingeniería genética, inhibiendo esta enzima (es decir, inhibiendo la producción de proteínas mutadas que son tóxicas para la célula hospedadora). Por consiguiente, se rescata el crecimiento celular puesto que no se producen más proteínas tóxicas y se puede confirmar que la sustancia administrada es un candidato a fármaco. Esto se debe al hecho de que el sitio catalítico de la ARS obtenida por ingeniería genética no se ha manipulado y, por tanto, la sustancia que se une al sitio activo de la enzima obtenida...

1. Método de cribaje para identificar un candidato a fármaco en el que dicho método comprende los siguientes pasos:

2. El método de cribaje de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector de expresión usado en el paso (c) también comprende una secuencia génica que codifica un sustrato de ARNt de la aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural.

3. El método de cribaje de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células de mamífero se transforman en el paso (d) usando un segundo vector de expresión que comprende una secuencia génica que codifica un sustrato de ARNt de la tRNA sintetasa de origen natural.

4. El método de cribaje de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la aminoacil-tRNA sintetasa que resulta del paso (b) es defectuosa en el reconocimiento del ARNt.

5. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural del paso (a) tiene actividad de edición y la aminoacil-tRNA sintetasa que resulta del paso (b) es defectuosa en edición.

6. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la aminoacil tRNA sintetasa se modifica por ingeniería genética por mutagénesis dirigida.

7. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en un plásmido viral o no viral, cósmido, fagémido, vector lanzadera y yak.

8. El método de cribaje de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector de expresión es un vector adenovirus.

9. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que el vector comprende un sistema de regulación dependiente de tetraciclina para la expresión del gen.

10. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el vector comprende un marcador de selección.

11. El método de cribaje de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el marcador de selección es higromicina.

12. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la aminoacil-tRNA sintetasa proviene de una bacteria y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antibacteriano.

13. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la tRNA sintetasa proviene de un hongo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antifúngico.

14. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la tRNA sintetasa proviene de un protozoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antiparasitario.

15. El método de cribaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la tRNA sintetasa proviene de un metazoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente antimetazoo.