MEDIOS CROMATOGRAFICOS.

Medios cromatográficos que comprenden partículas de resinas polímeras derivadas con polietilenimina en la superficie del polímero y funcionalizadas mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera,

en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídridos de ácidos, agentes de sulfonación, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos y cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas

Medios cromatográficos.

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación y el uso de nuevos medios cromatográficos, preferentemente medios cromatográficos polímeros de modo mixto para la separación y purificación de diversas biomoléculas como péptidos, proteínas y antibióticos. Más particularmente, la presente invención describe nuevos medios cromatográficos preferentemente intercambiadores aniónicos mixtos, intercambiadores de aniones-cationes mixtos e intercambiadores hidrófobos. Los medios cromatográficos se preparan mediante la modificación de polímeros con polietilenimina y su funcionalización. Se ha descubierto inesperadamente que estos medios polímeros de modo mixto ofrecen una capacidad de separación y capacidad de unión a proteínas mejoradas.

Antecedentes de la invención

El análisis de mezclas de proteínas mediante medios de cromatografía de intercambio iónico está bien documentado, como por medio de Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996). Más recientemente, el desarrollo de fármacos basados en proteínas y vacunas ha aumentado la necesidad de una purificación a mayor escala de las mezclas de proteínas. Es altamente deseable que los medios cromatográficos de intercambio iónico puedan ser utilizados en este campo.

Una forma de preparar estos materiales de medios cromatográficos, particularmente intercambiadores aniónicos que contienen una funcionalidad de amina primaria y secundaria, es mediante el revestimiento interno de materiales de sílice porosa con polietilenimina (PEI). Por ejemplo, el revestimiento de la superficie interna de partículas de sílice con polietilenimina seguido de inmovilización a través de una reticulación ha sido descrito por Alpert and Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392 (1979) y el uso de materiales preparados de esta forma para la separación cromatográfica de oligonucleótidos sintéticos ha sido descrito por Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983).

Análogamente, la preparación de partículas de sílice porosa revestidas con PEI o partículas de vidrio poroso controladas obtenidas mediante el enlace covalente de polietileniminopropil-trimetoxi-silano ha sido descrita en el documento US 4.540.486 de JT Baker Chemical Co. La misma patente describe la formación de resinas cromatográficas que tienen una funcionalidad mixta de base débil/ácido débil mediante la reacción de sílice revestida con PEI con anhídridos carboxílicos cíclicos. Se ha mostrado que estos materiales, cuanto son usados en una columna cromatográfica, pueden separar mezclas de citocromo C, glicoproteína ácida alfa-1, ovalbúmina y beta-lactoglobulina (medios de bases débiles) o ovalbúmina, citocromo C, hemoglobina y lisozima (medios mixtos de base débil/ácido débil). La eficacia de la sílice porosa derivada con PEI, o su versión carboxilada en la purificación de inmunoglobulina G ha sido demostrada también el documento US 4.606.825 de la empresa JT Baker Chemical Co.

La forma acilada de la sílice revestida con PEI anteriormente descrita puede ser adicionalmente convertida en unos medios de funcionalidad mixta de ácido débil/ácido fuerte mediante la introducción de grupos sulfónicos, como se describe en el documento US 4.721.573 de la empresa JT Baker Chemical Co. Una columna rellena de estos medios sulfonados permite la separación de una mezcla de citocromo C, hemoglobina lisozima y ovalbúmina, así como la separación de los componentes proteicos de un medio de cultivo de hibridomas.

Las partículas de sílice a las que se ha enlazado covalentemente PEI pueden ser convertidas también en medios cromatográficos hidrófobos mediante reacción con cloruros de monoacilo o anhídridos carboxílicos lineales en los que el grupo acilo puede ser una cadena hidrocarbonada lineal, un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido. Unos medios cromatográficos de fase de base débil/inversa basados en sílice preparados de esta forma, usando cloruro de butirilo, separa citocromo C, mioglobina, lisozima ovalbúmina y alfa-quimotripsínogeno, como se describe en el documento US 4.551.245 de JT Baker Chemical Co.

Han sido descritos gránulos de agarosa que portan grupos de intercambio iónico al final de un brazo de poli(alcohol vinílico) (PVA) en el documento WO 98/58732 de Amersham. Sin embargo, al contrario que la presente invención, los brazos separadores de PVA no contribuyen a ninguna capacidad de intercambio iónico en el producto ni proporcionan por sí mismas ninguna de las funcionalidades en un producto de modo mixto.

Una de las principales desventajas de los rellenos cromatográficos basados en sílice es su falta de estabilidad a un pH elevado. Esto es particularmente cierto para aplicaciones que incluyen la purificación de fármacos, ya que el tratamiento de la instalación con hidróxido de sodio 1 N es una práctica de esterilización común.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona medios cromatográficos que son capaces de minimizar o evitar esta falta de estabilidad a pH elevado. Los medios cromatográficos de la invención se exponen en la reivindicación 1. La invención proporciona también medios cromatográficos de modo mixto. Se ha descubierto que una forma posible de evitar este problema de inestabilidad es usar rellenos cromatográficos basados en un soporte polímero derivado sobre la superficie del polímero (es decir, no reticulado) con PEI, y estos medio derivados en la superficie según la invención, pueden ser adicionalmente funcionalizados mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con los grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera, como se expone en la reivindicación 1. De acuerdo con esta invención, se pueden proporcionar preferentemente medios de modo mixto como, por ejemplo, medios con sitios de intercambio de aminas mixtas primarias, secundarias y terciarias, medios con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles, medios con sitios de intercambio de cationes débiles y cationes fuertes, medios con sitios de intercambio de aniones débiles e hidrófobos (fase inversa) y medios con anión débil y anión fuerte. Además de ello, se descubrió inesperadamente que estos derivados polímeros mediante derivación con polietilenimina y funcionalizados y los medios cromatográficos basados en los mismos proporcionan características de separación diferentes y únicas. En un aspecto de la presente invención, se proporcionan medios cromatográficos polímeros para bioseparaciones. Esta invención difiere de los medios cromatográficos polímeros actuales en el método de preparación y las características de los medios, ya que estos medios cromatográficos actuales son intercambiadores iónicos simples. También, los medios de la presente invención difieren de los medios actuales basados en sílice en términos del método de preparación, composición, uso y rendimiento. Sorprendentemente, los medios polímeros de modo mixto preparados según esta invención tienen capacidades mejoradas de separación y enlace.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se ilustra, pero sin limitación, por medio de los dibujos que se acompañan, en los cuales:

La Figura 1 (ilustrativa) es un gráfico del perfil de elusión, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo preparativo 1 y medios de sílice y PEI según el procedimiento del ejemplo 34;

La figura 2 es un gráfico del perfil de elusión, registrado mediante un detector UV de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 9 y medios de sílice de modo mixto según el procedimiento del ejemplo 35;

Las figuras 3a y 3b son gráficos del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 19 y medios de sílice según el procedimiento del ejemplo 37;

La Figura 4 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 20 según el procedimiento del ejemplo 38;

La Figura 5 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de productos usando medios preparados según el ejemplo 22 y según el procedimiento del ejemplo 39;

La Figura 6 es un gráfico del perfil de elución, registrado mediante un detector UV, de la separación de proteínas usando medios preparados según el ejemplo 23 y según...

1. Medios cromatográficos que comprenden partículas de resinas polímeras derivadas con polietilenimina en la superficie del polímero y funcionalizadas mediante la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos aminos terminales de la polietilenimina en la superficie de la resina polímera, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídridos de ácidos, agentes de sulfonación, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos y cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas.

2. Medios cromatográficos según la reivindicación 1, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en anhídridos carboxílicos cíclicos, anhídridos carboxílicos insaturados, bisulfitos, cloruros de alquilo, anhídridos alquílicos, cloruros de alquilo que contienen una funcionalidad de amonio cuaternario y sus mezclas.

3. Medios cromatográficos según la reivindicación 2, en los que el reactivo de funcionalización se selecciona entre el grupo que consiste en: anhídrido glutárico, anhídrido succínico, anhídrido maleico, meta-bisulfito de sodio, cloruro de butirilo, anhídrido acético, anhídrido butírico, cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamonio y sus mezclas.

4. Medios cromatográficos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que los medios están en modo mixto.

5. Medios cromatográficos según la reivindicación 4, en que los medios de modo mixto se seleccionan entre el grupo que consiste en medios con sitios de intercambio mixtos de aminas primarias, secundarias y terciarias, medios con sitios de intercambio de aniones débiles y cationes débiles, medios con sitios de intercambio de cationes débiles y cationes fuertes, medios con sitios de intercambio de aniones débiles e hidrófobos (fase inversa) y medios con sitios de intercambio de aniones débiles y aniones fuertes.

6. Una columna para cromatografía, que está rellena con medios cromatográficos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Un procedimiento para la separación de componentes de una solución, que comprende hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía según la reivindicación 6 y eluir los componentes de la solución.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la solución es una solución que contiene proteínas.