KIT PARA PREPARAR UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE UNAS CELULAS ADIPOCITARIAS.

Kit para preparar una composición que comprende unas células adipocitarias,

comprendiendo dicho kit:

a) por lo menos un tubo estéril (1) apropiado para ser centrifugado, que comprende un cuerpo (11) y un tapón (12) que presenta un elemento de material elástico y retraíble, estando el cuerpo (11) herméticamente cerrado por el tapón (12), comprendiendo dicho tapón (12) un orificio de salida de aire (13) provisto de una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro inferior a 0,30 µm;

b) por lo menos una aguja estéril que comprende un canal central, del que uno de los extremos está provisto de un dispositivo de fijación a una jeringa, y del que el otro extremo está en forma de bisel, siendo el diámetro del canal central de 3 milímetros o más, preferentemente de 5 milímetros o más

Kit para preparar una composición que comprende unas células adipocitarias.

La presente invención se refiere al campo de la obtención de células adipocitarias, y a la aplicación de las composiciones celulares resultantes para la fabricación de composiciones con fines estéticos o médicos para regenerar localmente los tejidos, incluidos los tejidos adiposos.

Numerosos procedimientos de obtención de células precursoras de adipocitos son conocidos en el estado de la técnica.

En general, dichos procedimientos tienen en común una etapa de obtención de un tejido adiposo de partida, que procede de un lipoaspirado, que es seguida de una etapa de digestión enzimática del tejido adiposo, con el fin de liberar las células adipocitarias del tejido conjuntivo circundante, y después una etapa de purificación de las células precursoras de adipocitos.

En general, las células precursoras de adipocitos se utilizan a continuación por su capacidad, como células cepas, para diferenciarse en numerosos tipos celulares distintos, que se pueden utilizar en terapia.

Un procedimiento de este tipo se describe por ejemplo en la solicitud de patente americana US 2003/0082152 publicada el 1 de mayo del 2003. Según esta solicitud de patente americana, las células precursoras de adipocitos, una vez purificadas, se disponen en cultivo durante unos tiempos variables, y en presencia de diferentes factores solubles, con el fin de diferenciarse en unas células de diversos tipos celulares. Por ejemplo, se induce la diferenciación de las células precursoras de adipocitos en tejido osteógeno cuando se incuban en presencia de una combinación de dexametasona, de fosfato de acido ascórbico, y de beta-glicerofosfato. Para obtener una diferenciación de las células precursoras de adipocitos en células de tejido condrogénico, las células precursoras se incuban en presencia de suero de ternera fetal, de TGF-beta 1 y de insulina. Para inducir la diferenciación de las células precursoras de adipocitos en células de tejido miogénico, las células precursoras de adipocitos purificadas se incuban en presencia de suero de caballo y de hidrocortisona. Para inducir la diferenciación de las células precursoras de adipocitos en tejido adipogénico, las células precursoras de adipocitos purificadas se incuban en presencia de una combinación de isobutil-metilxantina, de dexametasona, de insulina y de indometacina.

Según otros procedimientos, las células precursoras de adipocitos, después de haber sufrido una etapa de purificación, son administradas a los pacientes sin la utilización de una etapa de diferenciación previa.

Dichos procedimientos de obtención de células precursoras de adipocitos comprenden una etapa de purificación de las células precursoras de adipocitos que puede ser de una duración y de una complejidad variable. La etapa de purificación puede consistir, o bien en una etapa de selección positiva de las células precursoras de adipocitos, o bien en una etapa de selección negativa en la que las células no deseadas son eliminadas, o también en una combinación de una etapa de selección positiva y de una etapa de selección negativa. La utilización de etapas de selección positiva y/o de etapas de selección negativa en un procedimiento de preparación de una fracción celular enriquecida con precursores de adipocitos comunes, se describe por ejemplo en la solicitud de patente americana US 2004/0106196 publicada el 3 de junio 2004.

En la solicitud de patente US 2004/0106196, se describe por ejemplo una etapa de selección positiva de las células precursoras de adipocitos por adherencia selectiva de las células precursoras, por ejemplo sobre ciertos tipos de soportes para membrana de filtración. Se puede también hacer uso de anticuerpos, o de combinación de anticuerpos que reconocen las moléculas de superficie expresadas sobre las células precursoras, o por el contrario sobre las otras células de la población celular de partida. Dichos anticuerpos son inmovilizados sobre un soporte solido, con el fin de retener selectivamente las células que expresan en su superficie los antígenos en contra de los que se dirigen los anticuerpos inmovilizados. La purificación de las células precursoras de adipocitos se puede realizar asimismo mediante separación inmunomagnética con la ayuda de anticuerpos apropiados. Asimismo, la etapa de purificación se puede ser realizar mediante una primera etapa de incubación de las células con unos anticuerpos dirigidos contra unos antígenos de superficie celular, y después el paso de las células así tratadas sobre una columna de inmunocromatografía en la que se inmovilizan los anticuerpos secundarios que se fijan sobre los anticuerpos primarios citados anteriormente. La etapa de purificación celular se puede realizar asimismo mediante la utilización de gradientes de densidad, continuos o discontinuos. La etapa de purificación de los precursores de adipocitos se puede realizar asimismo con la ayuda de aparatos de selección celular, tales como unos aparatos de elutriación, con o sin contracorriente. El estado de purificación de los precursores de adipocitos se puede realizar asimismo gracias a una etapa de adhesión selectiva de la población celular de partida sobre la superficie plástica de un soporte de cul-tivo.

Después de la purificación, las células precursoras de adipocitos purificadas como se ha descrito anteriormente pueden ser directamente administradas a los pacientes.

Se ha descrito asimismo un procedimiento de obtención de una fracción enriquecida con células adipocitarias que comprende una etapa de desagregación de fragmentos de tejido adiposo de un lipoaspirado en un primer contenedor, y después una etapa de enriquecimiento celular en un segundo contenedor, por ejemplo por separación sobre gradiente de densidad, centrifugación, elutriación, adherencia celular diferencial, selección por unos anticuerpos o también con la ayuda de bolas inmunomagnéticas (véase la solicitud de patente de los Estados Unidos US 2004/0106196).

Según los objetivos que se persiguen, los procedimientos del estado de la técnica descritos anteriormente pueden resultar plenamente satisfactorios, en particular para preparar unas poblaciones de células diferenciadas hacia diferentes tipos tisulares, o también cuando las aplicaciones terapéuticas previstas necesitan un grado muy alto de pureza de las células precursoras de adipocitos.

Sin embargo, los procedimientos de obtención de células precursoras de adipocitos descritos en el estado de la técnica, y por tanto los principales de entre ellos están ilustrados más arriba, son largos, y costosos y están por tanto destinados a corregir unas situaciones fisiológicas, en particular patológicas, susceptibles de poner en juego la vida del paciente.

Ahora bien, existe la necesidad en el estado de la técnica de unos procedimientos de obtención de células precursoras adipocitarias que sean más simples, más rápidos de realizar y mucho menos costosos que los procedimientos conocidos.

Según la invención, se ha puesto a punto un procedimiento de obtención de una fracción celular enriquecida con células adipocitarias, incluida una fracción enriquecida con células precursoras adipocitarias y de una fracción enriquecida con células de adipocitos maduras, más simple y menos costoso que los procedimientos conocidos, así como un kit específicamente ideado para la realización de este nuevo procedimiento.

Las "células adipocitarias" según la invención engloban las células precursoras y las células de adipocitos maduras.

Por "células precursoras" o "células precursoras adipocitarias", se entienden según la invención las células cepas contenidas en el tejido adiposo y que son capaces, en las condiciones apropiadas, de diferenciarse en unas células de diversos tipos celulares, como se ha descrito en el estado de la técnica.

Según la invención, las "células precursoras" engloban las células multipotentes y pluripotentes que son capaces de diferenciarse en una diversidad de tipos celulares, incluidas las células adipogénicas, condrogénicas, cardiogénicas, dermatogénicas, hematopoyéticas, hemangiogénicas, miogénicas, nefrogénicas, urogenitogénicas, osteogénicas, pericardiogénicas o también estromales.

El solicitante se ha aplicado en poner a punto un kit destinado a la preparación de una composición que comprende unas células adipocitarias que permite la utilización de un procedimiento simple de obtención de dicha composición, que se puede utilizar en rutina por el facultativo...

1. Kit para preparar una composición que comprende unas células adipocitarias, comprendiendo dicho kit:

2. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque el tapón (12) del tubo estéril (1) comprende por lo menos una superficie de perforación (14) estéril recubierta por una película amovible (15).

3. Kit según la reivindicación 2, caracterizado porque el tapón (12) del tubo estéril (1) comprende de 2 a 5 superficies de perforación (14).

4. Kit según la reivindicación 2, caracterizado porque el tapón (12) del tubo estéril (1) comprende más de 5 superficies de perforación (14).

5. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tubo estéril (1) contiene una preparación enzimática apropiada para la digestión del tejido adiposo, estando dicha preparación enzimática en forma líquida o en forma liolifilizada.

6. Kit según una de las reivindicación 1 a 4, caracterizado porque el tubo estéril (1) no comprende una preparación enzimática.

7. Kit según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un contenedor que contiene una preparación enzimática apropiada para la digestión del tejido adiposo, estando dicha preparación enzimática en forma líquida o en forma liofilizada.

8. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 tubos estériles (1).

9. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende un frasco que contiene un medio hipotónico adaptado para la lisis de los hematíes.

10. Kit según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque dicho medio hipotónico posee un pH comprendido entre 7,2 y 7,6.

11. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende un frasco que contiene un medio isotónico adecuado para la nueva puesta en suspensión de las células.

12. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende por lo menos un dispositivo estéril de filtración provisto de una membrana filtrante que tiene un tamaño de poro comprendido entre 40 µm y 200 µm.

13. Kit según la reivindicación 12, caracterizado porque el dispositivo estéril de filtración comprende asimismo una aguja estéril de por lo menos 16 Gauges.

14. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende asimismo por lo menos una aguja de más de 18 Gauges.

15. Kit según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende además un dispositivo (2) que permite la obtención de una composición de mezcla de células precursoras con una matriz biológica, estando dicho dispositivo constituido por:

16. Procedimiento de obtención de una composición que contiene unas células adipocitarias, que comprende las etapas siguientes:

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque en la etapa f), cuando la mezcla se realiza a la vez con las células de la fracción (PA) y con las células de la fracción (AM), la relación celular (PA)/(AM) está comprendida entre 1/99 y 99/1.

18. Tubo estéril (1) apropiado para ser centrifugado, que comprende un cuerpo (11) y un tapón (12) que comprende un elemento de material elástico y retraíble, estando el cuerpo (11) herméticamente cerrado por el tapón (12), presentando dicho tapón (12) un orificio de salida de aire (13) provisto de una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro inferior a 0,30 µm.

19. Tubo estéril (1) según la reivindicación 18, caracterizado porque el tapón (12) del tubo estéril (1) comprende por lo menos una superficie de perforación (14) estéril recubierta con una película amovible (15).

20. Tubo estéril (1) según una de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el tapón (12) del tubo estéril (1) comprende por lo menos dos superficies de perforación (14).

21. Tubo estéril (1) según una de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque contiene una preparación enzimática apropiada para la digestión del tejido adiposo, estando dicha preparación enzimática en forma líquida o en forma liofilizada.