Método para reacciones químicas o bioquímicas que implican templado repetido y homogeneización,

que comprende las etapas de

a) cargar un recipiente de reacción con una mezcla de reacción que va a incubarse homogéneamente,

b) someter dicho recipiente de reacción y su contenido a una fuerza centrífuga, y

c) ajustar la mezcla de reacción en dicho recipiente de reacción a una temperatura apropiada para una reacción deseada bajo dicha fuerza centrífuga, mediante lo cual la dirección de la fuerza centrífuga que actúa sobre subconjuntos más densos de la mezcla de reacción conduce a una mezcla de reacción homogénea completamente mezclada y a una distribución de temperatura homogénea en la masa de la mezcla de reacción

Homogeneización de mezclas de pequeño volumen mediante centrifugación y calentamiento.

La presente invención se refiere a un dispositivo y método para reacciones químicas o bioquímicas que implican templado repetido y homogeneización de la mezcla de reacción, y en particular reacciones químicas en medios líquidos.

Antecedentes de la invención

Muchos procesos industriales importantes, así como procedimientos aplicados en los laboratorios de diferentes tipos dependen de reacciones químicas. Normalmente, el tiempo consumido para completar un proceso o procedimiento se determina por el tiempo que tarda alguna reacción o reacciones químicas específicas en alcanzar el equilibrio. A menudo esto se denomina propiedades cinéticas de una reacción química o sencillamente cinética de reacción. Una gran cantidad de variables influyen en la cinética de reacción en cada caso, por ejemplo, las concentraciones de los reactivos, temperatura, presencia de agentes catalíticos, etc.

Normalmente, la temperatura elevada hace más rápidas las reacciones químicas al acelerar mecanismos clave como el poner en contacto moléculas o dominios de moléculas entre sí. Por lo tanto, es común calentar los recipientes de reacción, por ejemplo, poniéndolos en contacto con una llama abierta, gas caliente, líquido caliente, arena caliente o un material sólido. Este procedimiento se denomina con frecuencia incubación.

Un problema típico relacionado con las incubaciones de mezclas de reacción fluidas es la heterogeneidad térmica, porque las partes de la mezcla de reacción que están en contacto estrecho con las paredes del recipiente de reacción se calentarán antes que las partes más hacia el centro de la mezcla de reacción. En muchos casos existe el riesgo de que una parte de la mezcla de reacción se sobrecaliente antes de que otras partes alcancen incluso la temperatura deseada. Esto lleva a que se formen gradientes de temperatura en la mezcla de reacción. Los subconjuntos calientes de la mezcla de reacción tienen normalmente una densidad inferior a la de subconjuntos fríos lo que tiende a generar gradientes de temperatura o fases diferenciadas de volúmenes de líquido más o menos isotérmicos, denominadas termoclinos. Por lo tanto, partes calientes, menos densas de la mezcla de reacción tienden a encontrar una posición encima de partes frías, más densas. El movimiento molecular y las corrientes en la mezcla de reacción, homogenizarán eventualmente la mezcla de reacción con respecto a la temperatura, un proceso denominado templado de la mezcla de reacción. El tiempo que se tarda en templar una mezcla de reacción puede contribuir sustancialmente al tiempo necesario para la reacción completa.

Sin embargo, el consumo de tiempo, en si mismo, no es el único problema implicado con el templado de mezclas de reacción químicas. En ciertos procedimientos de incubación, tales como los templados repetitivos implicados en los denominados procesos de termociclado, por ejemplo, para llevar a cabo las reacciones en cadena de la polimerasa, también conocidas como reacciones PCR, los largos periodos de templado también conducen a reacciones secundarias no deseadas, que a veces provocan problemas graves de calidad con respecto a la exactitud y la especificidad de los productos de PCR obtenidos.

En el esfuerzo continuo para miniaturizar los volúmenes de las reacciones químicas, como es evidente, por ejemplo, en el campo de la selección de alto rendimiento, se encuentran muchos otros problemas. En un recipiente de reacción pequeño, tal como un pocillo en una placa de microtitulación, tanto el mezclado como el templado de la muestra y los reactivos, pueden resultar gravemente limitados. Cuando dos o más fluidos miscibles se mezclan, se supone normalmente que forman en primer lugar una mezcla homogénea, que luego reacciona. Sin embargo, este caso es poco común.

Las placas de microtitulacion y cubetas, convencionales frecuentemente se fabrican de poliestireno, un polímero hidrófilo. Sin detenerse en el comportamiento exacto del líquido en los limites del recipiente, puede concluirse que se formarán zonas estancadas, y que se producirá fácilmente un mezclado insuficiente en un recipiente de reacción pequeño, tal como un pocillo en una placa de microtitulacion. Las propiedades de los reactivos y los fluidos de muestra también influyen en su interacción entre si y con los limites del recipiente. La segregación parcial, la formación de fases, la agregación, etcétera, son sólo algunos ejemplos de irregularidades que pueden encontrarse en un recipiente de reacción.

Hay razones para distinguir entre dos procesos diferentes que causan problemas con la distribución de temperatura heterogénea en una mezcla de reacción. El proceso causado por la menor fluidez cerca a las paredes de un recipiente de reacción, es un problema que aumenta cuando la escala de la reacción disminuye. Por el contrario, el problema implicado con que las partes centrales del volumen de líquido sean más frías que el líquido cerca a las paredes al calentar un recipiente de reacción, aumenta cuando la escala de reacción aumenta. Ésta es la razón por la cual los dispositivos de termociclado para procesos en los que se requiere un templado adecuado (por ejemplo, procesos como la PCR) tienen un intervalo dinámico muy estrecho con respecto a la escala de reacción. Típicamente, en las reacciones PCR, estos problemas son más graves cuando los volúmenes de reacción son inferiores a 5 µL y superiores a 50 µL.

Otro problema, aparentemente sin relación con las cuestiones de mezclado y templado, es el de la evaporación. Con el fin de evitar la evaporación, existe una tendencia a hacer que los recipientes de reacción y, en particular, los pocillos en las placas de microtitulación sean más profundos y estrechos. Naturalmente, esto aumenta adicionalmente los problemas anteriormente mencionados de templado y mezclado insuficiente.

Hasta ahora, la heterogeneidad de temperatura se ha tratado en términos de propiedades en un recipiente de reacción individual. Especialmente cuando se trata la miniaturización de los ensayos, debe considerarse otra dimensión más de la heterogeneidad de la templado; la de la variación entre los recipientes de reacción. En ensayos con fines comparativos (es decir, con o sin el análisis cuantitativo, como en la selección de nuevos candidatos de fármacos, mutaciones en ácidos nucleicos, el polimorfismo de un solo nucleótido, etcétera), es importante considerar la reproducibilidad, comúnmente denominada la uniformidad entre pocilios.

Dado que los procesos que conducen a una mala uniformidad térmica son difíciles de predecir cuantitativamente, la única solución disponible al problema es con frecuencia centrarse en medios para mejorar los procesos de homogeneización. Para lograr esto, se aplican diversas estrategias.

Una es usar recipientes de reacción con configuraciones oblongas o planas especificas con el fin de minimizar la distancia entre las zonas centrales y periféricas de la masa de la mezcla de reacción, ün ejemplo de esto es llevar a cabo la incubación en capilares finos tal como se describe por Wittwer, CT et al., (The LightCycler: A Microvolume Multisample Fluorimeter with Rapid Temperature Control, Bio-Techniques 22:176-181, enero de 1997). Una desventaja de este enfoque es que los capilares de vidrio, poco unidos a sus partes de sujeción plásticas, requieren una extensa manipulación manual. La elección de los capilares de vidrio hace posible tanto el rápido templado de la mezcla de reacción como la detección de fluorescencia después de la amplificación. Sin embargo, un capilar de vidrio tiende a maximizar el contacto superficie-fluido, con todas las consecuencias que esto tiene sobre el mezclado y el templado. Además, el uso de capilares de vidrio tiene el inconveniente adicional de obstruir el procesamiento de la muestra tras la PCR. Ejemplos de procesamiento tras la PCR incluyen los procedimientos de secuenciación del ADN, etc.

Otras formas de resolver el problema de la heterogeneidad de la temperatura y el mezclado es introducir perturbaciones agitando o sacudiendo el recipiente de reacción. Instrumentos específicos diseñados para este fin son, por ejemplo, diversas clases de agitadores de matraz y las denominadas máquinas Vortex. Un problema a menudo encontrado con este enfoque es que la periodicidad de la perturbación puede causar corrientes u ondas estancadas y por consiguiente homogeneidad incompleta.

Otro enfoque para la homogeneización es el uso de ondas ultrasónicas en un procedimiento...

1. Método para reacciones químicas o bioquímicas que implican templado repetido y homogeneización, que comprende las etapas de