COLINA OXIDASAS.

Colina oxidasa, cuya secuencia de aminoácidos coincide con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq.

1, o cuya secuencia de aminoácidos coincide en al menos un 85% con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq. 1, y la cual puede obtenerse de una colina oxidasa cuya secuencia de aminoácidos coincide con la secuencia de aminoácidos indicada en la Seq. 1, mediante uno o múltiples intercambios de aminoácido conservativos

Colina oxidasas.

La presente invención se refiere a nuevas colina oxidasas, a métodos para su obtención, productos para el cuidado corporal, productos para el cuidado del pelo, productos para lavar el pelo, productos para el cuidado de la boca, los dientes y las prótesis dentales, cosméticos, detergentes, productos de limpieza, productos para enjuague posterior, productos para lavar las manos, productos para lavar platos a mano, productos para lavar platos en máquina, que contienen nuevas colina oxidasas, así como usos de las nuevas colina oxidasas.

Son conocidas colina oxidasas del estado de la técnica (Ikuta, S., Imamura, S., Misaki, H., and Horiuti, Y. 1977. Purification and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. J Biochem (Tokyo) 82: 1741-1749., Deshnium, P., Los, D.A., Hayashi, H., Mustardy, L., and Murata, N. 1995. Transformation of Synechococcus with a gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress. Plant Mol Biol 29: 897-907.). La solicitud internacional de patente WO99/37786 también divulga una colina oxidasa y su uso en plantas transgénicas. También se conoce que pueden emplearse oxidasas (alcohol oxidasas, aminoácido oxidasas) junto con sus sustratos para la generación de peróxido de hidrógeno para el blanqueamiento e inhibición de transferencia de color en detergentes o para el tinte enzimático de cabello y blanqueamiento en productos cosméticos.

En la WO 97/21796 se describe que oxidasas liberan peróxido de hidrógeno de sus respectivos sustratos en condiciones técnicas (por ejemplo, de una matriz de detergente) con ayuda del oxígeno del aire y por esto pueden emplearse para el blanqueamiento. La formación de peróxido de hidrógeno se efectúa de manera continua y la eficiencia de la formación de producto mediante la estabilidad de temperatura y de pH, así como se determina la tolerancia frente al sustrato y al producto.

Para el blanqueamiento químico convencional se emplean suministradores de peróxido de hidrógeno alcalinos, inorgánicos como percarbonato o perborato. En combinación con propulsores de blanqueamiento (TAED). El peróxido de hidrógeno componente de blanqueamiento surge por descomposición espontanea del compuesto de adición y da lugar a concentraciones altas rápidamente pero fugazmente. No es posible un blanqueamiento suave.

Para el empleo en formulaciones líquidos acuosos no se encuentra disponible ningún sistema de blanqueamiento.

Para el tinte de cabello se realiza convencionalmente un blanqueamiento para la nivelación de los tonos grises antes de la tintura con peróxido de hidrógeno y solución de amoniaco. Las concentraciones de peróxido de hidrógeno altas de corto plazo con el pH alcalino llevan a un daño sensible del pelo. No se encuentra disponible un pre-tratamiento sin amoniaco, cargado de olor, con liberación continua de peróxido de hidrógeno a un pH neutral o débilmente básico.

De manera sorprendente se ha encontrado que las colina oxidasas pueden aislarse a partir de las bacterias Arthrobacter nicotianiae y Arthrobacter aurescens y pueden usarse en sistemas de blanqueamiento mientras que se evitan en gran medida las desventajas asociadas con el estado de la técnica relevante.

Es objeto de la presente invención es por lo tanto una colina oxidasa tal como define en las reivindicaciones 1 y 2.

Las colina oxidasas de acuerdo con la invención se basan en nuevas oxidasas aisladas por primera vez por la solicitante a partir de Arthrobacter nicotianiae (Seq. 1).

Las colina oxidasas según la invención son capaces de liberar peróxido de hidrógeno de manera continua a partir de colina y derivados de colina con ayuda del oxígeno del aire formándose aldehído de betaína y betaína.

Las colina oxidasas según la invención tienen de manera ventajosa una alta velocidad específica de formación de hidrógeno.

El perfil de pH de la enzima según la invención es compatible con el pH requerido en el caso del empleo técnico así como con productos típicos tales como productos detergentes y de limpieza y tintes para el cabello.

El uso del sustrato colina y sus derivados, así como la formación del producto secundario como sustancia activa potencial para el avivamiento, da lugar a beneficios secundarios considerables.

Como sustrato puede tomarse en consideración, a manera de ejemplo, colina y derivados de aminoetanol N-sustituido, con las formas estructurales 1 ó 2:

Para la fórmula estructural 1 son válidas las definiciones:

R¹ = H, R² = 2-Hidroxietilo

R¹ = Metilo, R² = Metilo

R¹ = 2-Hidroxietilo, R² = 2-hidroxietilo.

Estos compuestos son conocidos de la literatura como sustratos para la colina oxidasa de A. globiformis.

Para la fórmula estructural 2 es válida la definición

R¹ = R² = R³ = Metilo.

Otro sustrato adecuado según la invención es aldehído de betaína (OHC-CH₂)N⁺(CH₃)₃.

También es de interés considerable para el cuidado del cabello la acción aditiva de la betaína que se forma.

En lo sucesivo, una expresión de la forma "al menos X %" significa "X % hasta 100% (incluyendo los valores de referencia límites X y 100 y todos los valores porcentuales de números enteros y números no enteros entre ellos)".

En el contexto de la invención debe entenderse por una proteína a un polímero en gran medida linealmente estructurado, que para ejercer su función adopta usualmente una estructura tridimensional. En la presente solicitud, los 19 L-aminoácidos proteinogénicos de procedencia natural se designan con los códigos internacionalmente habituales de 1 y 3 letras.

En el contexto de la presente solicitud debe entenderse por una enzima a una proteína que ejerce una determinada función biocatalítica.

Numerosas proteínas se forman como las así llamadas pre-proteínas, es decir junto con un péptido señal. Por esto debe entenderse entonces la parte N-terminal de la proteína cuya función usualmente consiste en garantizar la transferencia de la proteína formada afuera de la célula productora al periplasma o al medio circundante y/o su correcto doblez. A continuación, en condiciones naturales el péptido señal se disocia mediante una peptidasa señal del resto de la proteína, de modo que esta ejerce su actividad catalítica real sin los L-aminoácidos N-terminales presentes inicialmente.

Para aplicaciones técnicas, por sobre las pre-proteínas se prefieren los péptidos maduros debido a su actividad enzimática, es decir las enzimas procesadas después de su preparación.

Las pro-proteínas son precursores inactivos de las proteínas. Sus precursores con secuencia de señal se designan como pre-pro-proteínas.

En el contexto de la presente invención deben entenderse por ácidos nucleicos las moléculas, que sirven como portadores de información estructurados de manera natural como nucleótidos, las cuales codifican para la secuencia lineal de aminoácido en proteínas o enzimas. Pueden estar presentes como cadena individual, como una cadena individual complementaria a esta cadena individual o como cadena doble. Como el portador de información más duradero de manera natural, para trabajos moleculares-biológicos se prefiere el ácido nucleico ADN. Por contraste, para la realización de la invención en ambiente natural, como por ejemplo en una célula que expresa, se forma un ARN por lo cual las moléculas de ARN esenciales de la invención también representan formas de realización de la presente invención.

En el caso del ADN, las secuencias de las dos cadenas complementarias deberían considerarse respectivamente en todos los tres marcos de lectura posibles. Debe considerarse además que tripletes de codón diferentes pueden codificar para los mismos aminoácidos, de tal manera que una secuencia determinada de aminoácido puede derivarse de dos o más secuencias de nucleótido diferentes los cuales exhiben solo una identidad baja (degeneración del código genético). Además, diferentes organismos exhiben diferencias en su uso de estos codones. Por estas razones es necesario incluir secuencias de aminoácido como también secuencias de nucleótidos en la consideración del campo de protección y las secuencias...

1. Colina oxidasa, cuya secuencia de aminoácidos coincide con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq. 1, o cuya secuencia de aminoácidos coincide en al menos un 85% con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq. 1, y la cual puede obtenerse de una colina oxidasa cuya secuencia de aminoácidos coincide con la secuencia de aminoácidos indicada en la Seq. 1, mediante uno o múltiples intercambios de aminoácido conservativos.

2. Colina oxidasa, cuya secuencia de aminoácidos coincide hasta en un 100% con una de las secuencias de aminoácidos indicadas en Seq. 10 hasta Seq. 15.

3. Ácido nucleico que codifica para una colina oxidasa, según una de las reivindicaciones 1 ó 2 cuya secuencia de aminoácidos contiene una parte que es idéntica al menos en un 90%, particularmente preferible al menos un 95% y muy particularmente preferible hasta en un 100% con una de las secuencias de aminoácidos indicadas en Seq. 1 ó 10 hasta 15.

4. Ácido nucleico que codifica para una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 cuya secuencia de nucleótidos coincide en al menos un 85% con la secuencia de nucleótidos indicada en Seq. 4.

5. Ácido nucleico que codifica para una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 cuya secuencia de nucleótidos coincide en al menos 90%, particularmente preferible en al menos 95% y muy particularmente preferible hasta en un 100% con la secuencia de nucleótidos indicada en Seq. 4.

6. Ácido nucleico que codifica para una colina oxidasa cuya secuencia de nucleótidos coincide hasta en un 100% con una de las secuencias de nucleótidos indicadas en Seq. 17 hasta 22.

7. Oligonucleótido con una de las secuencias indicadas en Seq. 8 o Seq. 9 para usar como cebador PCR.

8. Sonda de ADN específica para una colina oxidasa bacteriana cuya secuencia de nucleótidos coincide en al menos un 85%, particularmente en al menos 90%, particularmente preferible en al menos 95% y muy particularmente preferible hasta en 100% con la secuencia de nucleótidos indicada en Seq. 7.

9. Uso de un oligonucleótido según la reivindicación 7 o de un ácido nucleico según la reivindicación 8 para la identificación y/u obtención de una colina oxidasa.

10. Uso de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 para la fusión o acoplamiento con otra proteína, en especial para el desarrollo de una nueva enzima.

11. Uso de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 hasta 6 para la fusión con otro ácido nucleico, en especial para el desarrollo de una nueva enzima.

12. Vector que contiene una de las regiones de ácidos nucleicos designadas en las reivindicaciones 3 hasta 6.

13. Vector de clonación según la reivindicación 12.

14. Vector de expresión según la reivindicación 12.

15. Célula huésped que contiene un vector según una de las reivindicaciones 12-14, y la célula es un microorganismo.

16. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada porque es una bacteria, en particular una que secreta la proteína formada al medio circundante.

17. Célula huésped según la reivindicación 16, caracterizada porque pertenece al género Escherichia, en particular a la especie Escherichia coli.

18. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada porque pertenece al género Bacillus, preferible a la especie Bacillus licheniformis, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

19. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada porque particularmente preferible pertenece al género de Arthrobacter y dentro de este género a la especie oxidans.

20. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada porque es una célula eucariótica, en particular una que modifica la proteína formada de modo post-translacional.

21. Uso de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 como agente generador in situ de peróxido de hidrógeno.

22. Uso según la reivindicación 24, caracterizada porque la colina oxidasa tiene la región de aminoácidos con la secuencia GxGxxG en la posición 20 hasta 25.

23. Uso según la reivindicación 22, caracterizada porque la secuencia GxGxxG significa GGGSAG.

24. Uso de una colina oxidasa según la definición en una de las reivindicaciones 21 a 23 para blanqueamiento, para inhibición de transferencia de color y para desinfección.

25. Productos para el cuidado del cuerpo, productos para lavar el cabello, productos para el cuidado del cabello, productos para el cuidado de la boca, los dientes y dentadura postiza, cosméticos, detergentes, productos para limpieza, productos para enjuague, productos para lavar las manos, productos para lavar platos a mano, productos para lavar platos en máquina, productos desinfectantes o productos para el tratamiento blanqueador o desinfectante de medios de filtro, textiles, pieles, papel, cuero, que contienen una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

26. Producto detergente o blanqueador que contienen un sistema blanqueador que está en la capacidad de generar peróxido de hidrógeno en las condiciones de aplicación del producto, y opcionalmente surfactante sintético, builder (auxiliar de detergente) orgánico y/o inorgánico así como otros componentes usuales de blanqueadores y detergentes, en particular activadores de blanqueamiento, preferiblemente TEAD, caracterizado porque el sistema de blanqueamiento se compone de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y de un sustrato para la colina oxidasa.

27. Producto según la reivindicación 26, caracterizado porque el sustrato es colina, aldehído de betaína o un derivado de colina.

28. Producto según la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque tiene una actividad de oxidasa de 3 U/g hasta 20 000 U/g.

29. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 28, caracterizado porque se presenta como como un polvo capaz de fluir con una densidad de carga 300 g/l hasta 1200 g/l, en particular de 500 g/l hasta 900 g/l.

30. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 28, caracterizado porque se presenta en forma de un detergente pastoso o líquido.

31. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 28 ó 30, caracterizado porque se presenta en forma de un detergente líquido no acuoso o de una pasta no acuosa.

32. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 28, 30 ó 31, caracterizado porque se presenta en forma de un detergente líquido acuoso o de una pasta con contenido de agua y se empaca en un contenedor impermeable al aire, del cual se libera brevemente antes del consumo o durante el procedimiento de lavado.

33. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 32, caracterizado porque la colina oxidasa y/o el sustrato para esta enzima está envuelto con una sustancia impermeable para la enzima y/o su sustrato a temperatura ambiente o en ausencia de agua y la sustancia se vuelve permeable en las condiciones de uso del producto para la enzima y/o su sustrato.

34. Producto según una de las reivindicaciones 26 hasta 33, caracterizada porque adicional al sistema de blanqueamiento contiene

35. Producto colorante de oxidación para tinturar fibras de queratina, en particular cabello, el cual contiene colina oxidasas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2.

36. Reactivo de señal para la generación de una emisión de luz en un ensayo de quimioluminiscencia el cual comprende una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2, un sustrato de colina oxidasa y un reactivo de quimioluminiscencia.

37. Reactivo de señal según la reivindicación 36, donde el sustrato de colina oxidasa se selecciona de entre colina, derivados de colina y aldehído de betaína.

38. Reactivo señal según la reivindicación 36 ó 37, donde el reactivo de quimioluminiscencia es luminol.

39. Uso de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de betaína.

40. Uso de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de productos alimenticios o partes componentes de productos alimenticios.

41. Uso de una colina oxidasa según una de las reivindicaciones 1 ó 2 para la elaboración de alimentos para animales y/o componentes de alimento para animales.