Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.

Un método de calibración de un sistema de imaginología para analizar una pluralidad de especies moleculares en una muestra

, comprendiendo dicho método:

adquirir una pluralidad de imágenes de la muestra con un dispositivo de adquisición de imágenes a una pluralidad de longitudes de onda diferentes;

comparar una región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda respectiva con una región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda diferente;

determinar un factor de aumento para cada una de una pluralidad de longitudes de onda a partir de una imagen de referencia, donde el factor de aumento caracteriza la diferencia de aumento entre una imagen tomada con respecto a una longitud de onda y otra imagen tomada con respecto a una longitud de onda diferente; y

alinear la pluralidad de imágenes de modo que la región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda respectiva corresponda a la región de interés asociada con la al menos una de las imágenes adquiridas a la longitud de onda diferente;

donde determinar el factor de aumento comprende:

capturar una imagen desenfocada de un portaobjetos de calibración en cada una de la pluralidad de longitudes de onda, comprendiendo el portaobjetos de calibración una cuadrícula de una pluralidad de celdas dispuestas en un patrón alterno, comprendiendo además cada celda una pluralidad de píxeles;

determinar un sombreado de cada uno de la pluralidad de píxeles para formar una máscara para discriminar entre un porcentaje de los píxeles más claros y un porcentaje igual de los píxeles más oscuros;

determinar un área para cada una de una pluralidad de celdas;

determinar un centro para cada una de una pluralidad de celdas;

medir una distancia entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas y sus celdas colindantes en la misma imagen;

afinar las mediciones de las áreas para cada una de la pluralidad de celdas y las mediciones de las distancias entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas, proporcionando el factor de aumento en base al promedio de las distancias medidas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2012/033053.

Solicitante: TRIPATH IMAGING, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 780 PLANTATION DRIVE BURLINGTON, NC 27215 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MARCELPOIL,RAPHAEL RODOLPHE, ORNY,CEDRICK RENE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > COMPUTO; CALCULO; CONTEO > TRATAMIENTO O GENERACION DE DATOS DE IMAGEN, EN GENERAL... > G06T5/00 (Perfeccionamiento o restauración de imagen, p. ej. desde un mapeado binario a un mapeado binario creando una imagen similar)
  • SECCION G — FISICA > COMPUTO; CALCULO; CONTEO > TRATAMIENTO O GENERACION DE DATOS DE IMAGEN, EN GENERAL... > G06T7/00 (Análisis de imagen, p. ej. desde un mapeado binario para obtener un mapeado no binario)

PDF original: ES-2542106_T3.pdf

 

google+ twitter facebookPin it
Ilustración 1 de Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.
Ilustración 2 de Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.
Ilustración 3 de Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.
Ilustración 4 de Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.
Ver la galería de la patente con 7 ilustraciones.
Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado.

Fragmento de la descripción:

Método para preparar videomicroscopía cuantitativa y sistema asociado

Campo de la invención

La presente invención se refiere al análisis de imágenes y, más particularmente, a un método para calibrar o preparar de otro modo un sistema de videomicroscopía para videomicroscopía cuantitativa en aplicaciones de biología celular y patología y a un sistema asociado y producto de programa de software informático para éste.

Antecedentes de la invención

El análisis eficaz de imágenes microscópicas es esencial en biología celular y patología, en particular para la detección y cuantificación de materiales genéticos, tales como por ejemplo genes o ARN mensajero, o la expresión 15 de esta información genética en forma de proteínas, tal como por ejemplo a través de amplificación génica, deleción génica, mutación génica, cuantificación de moléculas de ARN mensajero o análisis de la expresión de proteínas. La amplificación génica es la presencia de demasiadas copias del mismo gen en una célula, donde una célula contiene habitualmente dos copias del mismo gen, conocidas de otro modo como alelos. La deleción génica indica que puede encontrarse menos de dos copias de un gen en una célula. La mutación génica indica la presencia de genes incompletos o no funcionales. Los ARN mensajeros (ARNm) son moléculas de información genética sintetizadas a partir de un proceso de lectura de genes, que sirven como plantillas para la síntesis proteica. La expresión de proteínas es la producción de una proteína dada por una célula. Si está aumentada la codificación genética para una proteína dada, determinada a partir de un proceso de expresión de proteínas, o si está presente un exceso de copias del gen o del ARNm, la proteína puede estar sobreexpresada. A la inversa, si la codificación génica está suprimida o ausente, la proteína puede estar subexpresada o ausente.

Los comportamientos celulares normales están controlados de forma precisa por mecanismos moleculares que implican un gran número de proteínas, ARNm y genes. Se sabe que la amplificación génica, la deleción génica y la mutación génica tienen un papel prominente en comportamientos celulares anormales a través de la expresión de proteínas anormales. La gama de comportamientos celulares de relevancia incluye comportamientos tan diversos como, por ejemplo, regulación de proliferación o diferenciación. Por lo tanto, la detección y cuantificación eficaz en amplificación, deleción y mutación génicas, cuantificación del ARNm o análisis de la expresión de proteínas son necesarios para facilitar herramientas útiles de investigación, diagnóstico y pronóstico.

Existen numerosas técnicas de laboratorio dirigidas a la detección y cuantificación en amplificación, deleción y mutación génicas, cuantificación del ARNm o análisis de la expresión de proteínas. Por ejemplo, dichas técnicas incluyen técnicas de transferencias de Western, Northern y Southern, reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") , ensayo de inmunoseparación ligado a enzimas ("ELISA") , e hibridación genómica comparada ("CGH") . Sin embargo, la microscopía se utiliza de forma rutinaria dado que es una técnica informativa, que permite realizar investigaciones rápidas a nivel celular y subcelular, al mismo tiempo que puede implementarse rápidamente a un coste relativamente bajo.

Cuando la microscopía es la técnica de laboratorio elegida, las muestras biológicas deben someterse en primer lugar a preparaciones de detección y revelado. Una vez que las muestras están preparadas, un experto humano 45 típicamente analiza las muestras con un microscopio en solitario en un estudio cualitativo, o con un microscopio acoplado a una cámara y un ordenador en un estudio cuantitativo y generalmente estandarizado. En algunos casos, el microscopio puede estar configurado para análisis completamente automático, donde el microscopio está automatizado con platina y enfoque motorizados, cambiadores de objetivo motorizados, controles de intensidad de la luz automáticos y similares.

La preparación de las muestras para detección puede implicar diferentes tipos de técnicas de preparación que son adecuadas para el análisis microscópico de imágenes, tales como, por ejemplo, técnicas de preparación basadas en hibridación y basadas en inmunomarcado. Dichas técnicas de detección pueden acoplarse con técnicas de revelado apropiadas, tales como, por ejemplo, técnicas basadas en fluorescencia y basadas en reacciones cromáticas 55 visibles.

La hibridación in situ ("ISH") e hibridación fluorescente in situ ("FISH") son técnicas de detección y revelado usadas, por ejemplo, para detección y cuantificación en análisis de amplificación y mutación de información genética. Tanto la ISH como la FISH pueden aplicarse a muestras histológicas o citológicas. Estas técnicas usan sondas complementarias específicas para reconocer secuencias precisas correspondientes. Dependiendo de la técnica usada, la sonda específica puede incluir un marcador químico (ISH) o un marcador fluorescente (FISH) , donde después se analizan las muestras usando un microscopio de transmisión o un microscopio de fluorescencia, respectivamente. El uso de un marcador químico o un marcador fluorescente depende del objetivo del usuario, teniendo cada tipo de marcador ventajas correspondientes respecto al otro en casos particulares.

En análisis de la expresión de proteínas, pueden usarse técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") e

inmunocitoquímica ("ICC") , por ejemplo. La IHC es la aplicación de inmunoquímica a secciones de tejido, mientras que la ICC es la aplicación de inmunoquímica a células cultivadas o marcas de tejido después de que se han sometido a preparaciones citológicas específicas tales como, por ejemplo, preparaciones a base de líquido. La inmunohistoquímica es una familia de técnicas basadas en el uso de un anticuerpo específico, donde se usan anticuerpos para dirigirse específicamente a moléculas dentro de o sobre la superficie de células. El anticuerpo típicamente contiene un marcador que experimentará una reacción bioquímica y, de este modo, experimenta un cambio de color, al encontrarse con las moléculas diana. En algunos casos, la amplificación de señales puede estar integrada en el protocolo particular, donde un anticuerpo secundario, que incluye el colorante marcador, sigue la aplicación de un anticuerpo específico primario.

En estudios tanto de hibridación como de inmunomarcado, se usan cromógenos de diferentes colores para distinguir entre los diferentes marcadores. Sin embargo, el número máximo de marcadores que pueden usarse en un estudio está limitado por varios factores. Por ejemplo, el solapamiento espectral de los colores usados para revelar los respectivos marcadores puede ser un factor limitante, dado que los colorantes pueden absorber una gran parte del espectro visible. Por consiguiente, cuanto mayor sea el número de colorantes implicados en un estudio, mayor será el riesgo de solapamiento espectral. Además, la resolución espectral del dispositivo de adquisición puede ser un factor limitante y el desplazamiento cromático mínimo que el dispositivo es capaz de detectar debe ser considerado.

Además, generalmente se considera que la inmunohistoquímica, así como la química en ISH, muestran mala sensibilidad cuando debe conseguirse la cuantificación de un marcador. Sin embargo, la precisión de cuantificación de estas técnicas puede depender de varios factores. Por ejemplo, el tipo de reacción usada puede desempeñar un papel en la precisión de la técnica, dado que la linealidad de la relación entre la concentración del ligando y el grado de la reacción de tinción inmunohistoquímica... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de calibración de un sistema de imaginología para analizar una pluralidad de especies moleculares en una muestra, comprendiendo dicho método:

adquirir una pluralidad de imágenes de la muestra con un dispositivo de adquisición de imágenes a una pluralidad de longitudes de onda diferentes; comparar una región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda respectiva con una región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda diferente; determinar un factor de aumento para cada una de una pluralidad de longitudes de onda a partir de una imagen de referencia, donde el factor de aumento caracteriza la diferencia de aumento entre una imagen tomada con respecto a una longitud de onda y otra imagen tomada con respecto a una longitud de onda diferente; y alinear la pluralidad de imágenes de modo que la región de interés asociada con al menos una de las imágenes adquiridas a una longitud de onda respectiva corresponda a la región de interés asociada con la al menos una de las imágenes adquiridas a la longitud de onda diferente; donde determinar el factor de aumento comprende:

capturar una imagen desenfocada de un portaobjetos de calibración en cada una de la pluralidad de longitudes de onda, comprendiendo el portaobjetos de calibración una cuadrícula de una pluralidad de celdas dispuestas en un patrón alterno, comprendiendo además cada celda una pluralidad de píxeles; determinar un sombreado de cada uno de la pluralidad de píxeles para formar una máscara para discriminar entre un porcentaje de los píxeles más claros y un porcentaje igual de los píxeles más oscuros; determinar un área para cada una de una pluralidad de celdas;

determinar un centro para cada una de una pluralidad de celdas; medir una distancia entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas y sus celdas colindantes en la misma imagen; afinar las mediciones de las áreas para cada una de la pluralidad de celdas y las mediciones de las distancias entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas, proporcionando el factor de aumento en base al promedio de las distancias medidas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la imagen desenfocada se genera aplicando un filtro de paso bajo a una imagen enfocada de un portaobjetos de calibración, o ajustando el plano de enfoque en el eje z positivo o negativo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde medir la distancia entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas comprende medir la distancia en cada una de las direcciones norte, este, sur y oeste entre un centro de una celda y un centro de cada una de una celda colindante en las direcciones norte, este, sur y oeste.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde medir la distancia entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas comprende además:

determinar una media y una desviación típica de la distancia entre los centros de la pluralidad de celdas; y afinar una media de una pluralidad de distancias entre los centros de la pluralidad de celdas excluyendo del 45 cálculo de la media las distancias entre los centros de la pluralidad de caldas que están fuera de un intervalo de confianza.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde determinar las áreas para cada una de la pluralidad de celdas comprende además:

determinar una media y una desviación típica de las áreas para cada una de la pluralidad de celdas; y afinar una media de una pluralidad de áreas de la pluralidad de celdas excluyendo del cálculo de la media las áreas que están fuera de un intervalo de confianza.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde afinar las mediciones comprende además:

desplazar el portaobjetos de calibración en una dirección aleatoria; capturar una imagen desenfocada del portaobjetos de calibración desplazado; determinar un sombreado de cada uno de la pluralidad de píxeles en el portaobjetos de calibración desplazado para formar una máscara para discriminar entre un porcentaje de los píxeles más claros y un porcentaje igual de los píxeles más oscuros; determinar un área para cada una de una pluralidad de celdas en el portaobjetos de calibración desplazado; determinar un centro para cada una de una pluralidad de celdas en el portaobjetos de calibración desplazado; y medir una distancia entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde afinar las mediciones comprende además:

desplazar el portaobjetos de calibración en una dirección aleatoria una pluralidad de veces; capturar una imagen desenfocada del portaobjetos de calibración desplazado cada una de la pluralidad de veces que el portaobjetos es desplazado; determinar un sombreado de cada uno de la pluralidad de píxeles en cada uno de los portaobjetos de calibración desplazados para formar una máscara para discriminar entre un porcentaje de los píxeles que tienen el sombreado más claro y un porcentaje igual de los píxeles que tienen el sombreado más oscuro; determinar un área para cada una de la pluralidad de celdas en cada uno de los portaobjetos de calibración desplazados; determinar un centro para cada una de la pluralidad de celdas en los portaobjetos de calibración desplazados; y medir las distancias entre los centros de cada una de la pluralidad de celdas en los portaobjetos de calibración desplazados.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde adquirir la pluralidad de imágenes de la muestra comprende además explorar la imagen a una pluralidad de longitudes de onda diferentes, produciendo cada exploración un factor de desplazamiento en una primera y segunda dirección, definiendo el factor de desplazamiento la diferencia de desplazamiento entre una región de interés de una imagen tomada con respecto a una longitud de onda y una región de interés de una imagen tomada con respecto a una longitud de onda diferente.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde alinear la pluralidad de imágenes comprende además alinear una pluralidad de áreas de perfil de cada una de las imágenes con una pluralidad de áreas de perfil de una imagen de referencia.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, donde alinear la pluralidad de imágenes comprende además:

redimensionar la imagen mediante un factor de aumento; y mover la imagen redimensionada en una dirección horizontal y vertical.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además determinar una cantidad de especie molecular, tal como se indica mediante un colorante respectivo, para cada píxel en cada ubicación de píxel 30 correspondiente en la pluralidad de imágenes.

12. Un sistema de imaginología para analizar una cantidad de una pluralidad de especies moleculares en una muestra, comprendiendo dicho sistema:

un dispositivo de adquisición de imágenes configurado para adquirir una pluralidad de imágenes de la muestra a diferentes longitudes de onda; y un dispositivo procesador en comunicación con el dispositivo de adquisición de imágenes y configurado para llevar a cabo el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 12, donde el dispositivo de adquisición de imágenes comprende una cámara en blanco y negro.

14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 12, donde el dispositivo de adquisición de imágenes comprende una pluralidad de filtros, correspondiendo cada filtro a una longitud de onda diferente representativa de un colorante 45 respectivo en la muestra.

15. Un medio legible por ordenador codificado con un programa informático para calibrar un sistema de imaginología para determinar una cantidad de una pluralidad de especies moleculares en una muestra, siendo dicho medio legible por ordenador codificado con un programa informático ejecutable en un dispositivo informático y comprendiendo:

partes ejecutables para llevar a cabo el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.