Un método de obtención de una célula animal que contiene un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana que comprende:

a) proporcionar una población de células animales en un medio de cultivo; b) añadir una composición al medio de cultivo, composición que comprende: 1) un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5', que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosómico fijado como diana, regiones que juntas tienen al menos 24 nucleótidos de longitud, y son complementarias a la cadena codificante o a la no codificante del gen cromosómico fijado como diana y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosómico fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido o en ambas, codificando dicho al menos un nucleótido el cambio genético predeterminado; y 2) un vehículo macromolecular seleccionado entre el grupo constituido por i) una vesícula lipídica con núcleo acuoso, en la que el núcleo acuoso contiene el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla, ii) una nanoesfera lipídica, que comprende una sal lipolítica del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla, y iii) un policatión que tiene un peso molecular medio de entre 500 daltons y 1,3 Md en el que el policatión forma una sal con el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla; y c) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla, a algunos derivados de los mismos y amétodos de su uso para introducir un cambio predeterminado en una ubicación predeterminada en un gen diana en una célula viva. La célula puede ser una célula de mamífero, insecto, pez, gusano o ave, en un medio de cultivo artificial o en un organismo, una célula bacteriana o una célula vegetal. El gen diana puede ser un gen cromosómico o un genextracromosómico, es decir en un cromosoma artificial bacteriano.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han descrito técnicas de realización de un cambio predeterminado en una ubicación predeterminada en una secuencia de ácido nucleico diana de una célula. Estas técnicas utilizan las enzimas de la célula que conciernen a la reparación y a la recombinación homóloga del ADN. En estas técnicas se sintetiza un oligonucleótido o análogo deoligonucleótido que contiene dos regiones que tienen la secuencia del gen diana que flanquean a una región, denominada una “región mutadora”, que difiere del gen diana. En esta solicitud dichos oligonucleótidos y análogos sedenominarán de forma genérica “vectores mutacionales”. Dichos vectores mutacionales pueden introducir cambios genéticos predeterminados en un gen diana mediante un mecanismo que se cree que implica recombinación homólogay/o escisión y reparación de nucleótidos.

Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.565.350 y Nº 5.731.181 de Kmiec describen vectores mutacionales quecontienen cadenas complementarias en las que una primera cadena comprende análogos de ribonucleótidos queforman pares de bases de Watson-Crick con desoxirribonucleótidos de una segunda cadena. La Patente de EstadosUnidos Nº 6.004.804 de Kumar y Metz describe ciertas mejoras en vectores mutacionales de cadena doble, queincluyen una variante en la que la región mutadora está presente solamente en una de las dos cadenas. Es uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec en sistemas de mamíferos se describe en la Patente de Estados Unidos Nº

5.760.012 y, junto con vehículos macromoleculares, en la Publicación de Patente Internacional WO 98/49350 de Kren et al., y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada Nº de Serie 09/108.006. Descripciones adicionales deluso de vectores mutacionales de tipo Kmiec pueden encontrarse en los documentos Cole-Strauss et al., 1996, Science

273: 1386; Kren et al., 1998, Nature Med. 4: 285; y Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 10163.

El uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec en células vegetales se describe en las Publicaciones dePatente Internacional WO 99/25853 de Pioneer Hi-Bred International, WO 99/07865 de Kimeragen, Inc. y WO 98/54330de Zeneca Ltd. Las publicaciones científicas que describen el uso de vectores de tipo Kmiec en plantas incluyen losdocumentos Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774 y Zhu, et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

96: 8768.

El uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec y variantes de los mismos, que son de cadena doble, se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.004.804 de Kumar y Metz. La solicitud de Kumar y Metz enseña, entreotras cosas, que los vectores de tipo Kmiec y variantes de los mismos pueden usarse en células bacterianas.

El uso de oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla como vectores mutacionales para realizar cambios en ungen cromosómico en la levadura, S. cerevisiae, se describió en informes del laboratorio del Dr. F. Sherman, Universidad de Yale. Moerschell et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 524-528 y Yamamoto et al., 1992, Yeast 8: 935-948. Lalongitud óptima de los vectores mutacionales usados en estos estudios era de 50 nucleótidos.

Un informe aislado del uso de un polinucleótido de cadena sencilla y de cadena doble de 160 nucleótidos en unintento de realizar alteraciones en un gen cromosómico puede encontrarse en el documento Hunger-Bertling, 1990, Mol. Cell. Biochem. 92: 107-116. Los resultados para polinucleótidos de cadena sencilla fueron ambiguos debido a quesolamente se analizó el producto de los experimentos que usaban polinucleótidos de cadena doble.

El uso de un fragmento de ADN de cadena sencilla de 488 pares de bases para realizar cambios específicosen el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ha sido descrito por Goncz et al., 1998,Hum. Mol. Genetics 7: 1913; y Kunzelmann et al., 1996, Gene Ther. 3: 859.

Se usaron oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud encélulas de mamífero como control para estudios de genes episomales en los que el oligodesoxinucleótido se uniócovalentemente a un oligonucleótido que forma una triple cadena y que el oligodesoxinucleótido en solitario dio como resultado tasas de cambio genético predeterminado del gen episomal de aproximadamente 1 por 5 x 104, o menos. Chan et al., 1999, J. Biol. Chem. 74: 11541. Un informe anterior del uso de un oligodesoxinucleótido de cadena sencillapara realizar cambios predeterminados en un gen episomal en una célula de mamífero se encuentra en el documentoCampbell et al., 1989, The New Biologist 1: 223.

Un aspecto de la descripción se refiere a oligodesoxinucleótidos que han sido modificados mediante la uniónde un colorante de indocarbocianina. Se sabe que los colorantes de indocarbocianina son excelentes fluoróforos. Lasíntesis de indocarbocianina P cianoetil N,N diisopropil fosforamiditas bloqueadas que son adecuadas para su uso ensíntesis de nucleótidos en fase sólida se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.556.959 y Nº 5.808.044.

Un segundo aspecto de la descripción se refiere a una composición que comprende un oligonucleótido decadena sencilla que codifica un cambio genético predeterminado y a un vehículo macromolecular que comprende unligando para un receptor en la superficie de la célula diana. Una composición que comprende una poli-L-lisina, unligando para el receptor de asialoglucoproteínas y un oligodesoxinucleótido antisentido de entre 21 y 24 nucleótidos sedescribe en la Publicación de Patente Internacional WO 93/04701.

Un tercer aspecto de la descripción se refiere a una modificación de un oligodesoxinucleótido mediante la unión de un nucleótido unido en 3'-3'. La Patente de Estados Unidos Nº 5.750.669 enseña dicho oligodesoxinucleótido modificado.

La citación o identificación de cualquier referencia en la Sección 2, o en cualquier sección de esta solicitud nodebe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presenteinvención.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que los oligodesoxinucleótidos de cadenasencilla, particularmente cuando se modifican apropiadamente o se colocan en una composición con un vehículomolecular adecuado, pueden ser tanto o más eficaces en la realización de cambios genéticos predeterminados a genes diana en células que la técnica anterior, es decir vectores mutacionales de tipo Kmiec. Un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla adecuado para su uso de acuerdo con la presente invención se denomina en lo sucesivo en este documento un Vector Mutacional de Oligodesoxinucleótido de Cadena Sencilla o un SSOMV.

En una realización, la descripción proporciona una composición para su uso para realizar cambios en los genes cromosómicos de células animales, por ejemplo células de mamífero, constituida por el oligodesoxinucleótido quecodifica el cambio genético y un vehículo macromolecular. El vehículo puede ser un policatión, una vesícula lipídica connúcleo acuoso o una nanoesfera lipídica. En una realización adicional que es adecuada para uso in vivo, el vehículo comprende además un ligando que se une a un receptor de la superficie celular que es internalizado, tal como un ligando para un receptor en un pozo recubierto de clatrina, por ejemplo, el receptor de asialoglucoproteínas, el receptor de ácido fólico o el receptor de transferrina. En realizaciones preferidas, el oligodesoxinucleótido se modifica mediante launión de sustituyentes de bloqueo en 3' y 5' tales como un nucleótido citosina unido en 3'-3' y un colorante de indocarbocianina unido en 5'. En una realización alternativa, la modificación puede consistir en la sustitución del enlacefosfodiéster internucleotídico más en 3' y/o más en 5' por un enlace no hidrolizable, tal como un enlace fosforotioatodiéster... [Seguir leyendo]

1. Un método de obtención de una célula animal que contiene un cambio genético predeterminado en un gencromosómico fijado como diana que comprende:

a) proporcionar una población de células animales en un medio de cultivo;

b) añadir una composición al medio de cultivo, composición que comprende:

1) un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido delextremo 5', que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos y que tiene unasecuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosómico fijado como diana,regiones que juntas tienen al menos 24 nucleótidos de longitud, y son complementarias a la cadenacodificante o a la no codificante del gen cromosómico fijado como diana y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosómico fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido o en ambas, codificando dicho al menos un nucleótido el cambio genético predeterminado; y

2) un vehículo macromolecular seleccionado entre el grupo constituido por

i) una vesícula lipídica con núcleo acuoso, en la que el núcleo acuoso contiene el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla,

ii) una nanoesfera lipídica, que comprende una sal lipolítica del oligodesoxinucleótido de cadenasencilla, y

iii) un policatión que tiene un peso molecular medio de entre 500 daltons y 1,3 Md en el que el policatión forma una sal con el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla; y

c) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además aislar a la célula identificada.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la longitud del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla en de almenos 31 desoxinucleótidos y no superior a 59 desoxinucleótidos.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el vehículo macromolecular comprende además un ligando para unreceptor internalizable de la célula, ligando que está fijado a la superficie del vehículo macromolecular.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el receptor se selecciona entre el grupo constituido por el receptorde asialoglucoproteínas, el receptor de transferrina y el receptor del factor de crecimiento epidérmico.

6. El método de la reivindicación 4, en el que el receptor es el receptor de ácido fólico.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es un enlace fosforotioato.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' es un enlace fosforotioato.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5' está unido a unsustituyente de bloqueo en 5'.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el sustituyente de bloqueo en 5' es un colorante de indocarbocianina N1-hidroxialquilo sustituido y 3,3,3',3'-tetra sustituido, que está unido al hidroxilo 5' mediante un enlazador.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el colorante de indocarbocianina y el enlazador juntos son una Nhidroxipropil, N1-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonocarbocianina.

12. El método de la reivindicación 10, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es unenlace fosforotioato.

13. El método de la reivindicación 1, en el que el hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3' está unido a unsustituyente de bloqueo en 3'.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el sustituyente de bloqueo en 3' es un nucleótido de bloqueo queestá unido en 3'-3' al hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3'.

15. Un método de obtención de una célula animal que contiene un cambio genético predeterminado en un gencromosómico fijado como diana, que comprende:

a) proporcionar una población de células animales en un medio de cultivo;

b) añadir un compuesto al medio de cultivo; en el que dicho compuesto comprende: un oligodesoxinucleótido decadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5', que tiene al menos 25desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosómico fijado como diana, regiones que juntas tienen al menos 24 nucleótidos delongitud, y son complementarias a la cadena codificante o a la no codificante del gen cromosómico fijadocomo diana y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosómico fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido o en ambas, codificando dicho al menos unnucleótido el cambio genético predeterminado; y

c) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado.

16. El método de la reivindicación 15, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es unenlace fosforotioato.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' es unenlace fosforotioato.

18. Un método de obtención de una célula animal que contiene un cambio genético predeterminado en un gencromosómico fijado como diana, que comprende:

a) proporcionar una población de células animales en un medio de cultivo;

b) añadir una composición al medio de cultivo; en el que dicha composición comprende: un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5', que tiene al menos 25desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosómico fijado como diana, regiones que juntas tienen al menos 24 nucleótidos delongitud, y son complementarias a la cadena codificante o a la no codificante del gen cromosómico fijadocomo diana y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosómico fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido o en ambas, codificando dicho al menos unnucleótido el cambio genético predeterminado; y en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido delextremo 3' y al nucleótido del extremo 5' son enlaces fosforotioato, y

c) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado.

19. El método de la reivindicación 16, en el que un colorante de indocarbocianina N1-hidroxialquilo sustituido y 3,3,3',3'-tetra sustituido está unido al hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5' mediante un enlazador.

20. El método de la reivindicación 15, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' es unenlace fosforotioato.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es unenlace fosforotioato o en el que un nucleótido de desoxicitina o de timidina está unido en 3'-3' al hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3' o ambos.

22. Un método de obtención de una célula vegetal que contiene un cambio genético predeterminado en un gencromosómico fijado como diana, que comprende:

a) introducir un compuesto en una población de células vegetales; en el que dicho compuesto comprende unoligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5',que tiene al menos 21 desoxinucleótidos y no más de 55 desoxinucleótidos y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen fijado como diana, regiones que juntas tienen almenos 20 nucleótidos de longitud, y son complementarias a la cadena codificante o a la no codificante del gencromosómico fijado como diana y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuenciadel gen fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla o en ambas, codificando dicho al menos un nucleótido el cambio genético predeterminado; y

b) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende además aislar a la célula identificada.

24. El método de la reivindicación 22, en el que el hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5' está unido a unsustituyente de bloqueo en 5'.

25. El método de la reivindicación 24, en el que el hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3' está unido a unsustituyente de bloqueo en 3'.

26. El método de la reivindicación 25, en el que

a) el sustituyente de bloqueo en 5' es un colorante de indocarbocianina N1-hidroxialquilo sustituido y 3,3,3',3'-tetra sustituido, que está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5'; y

b) el sustituyente de bloqueo en 3' es un nucleótido de bloqueo que está unido en 3'-3' al hidroxilo 3' delnucleótido del extremo 3'.

27. El método de la reivindicación 26, en el que el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla tiene al menos 25desoxinucleótidos y no más de 35 desoxinucleótidos de longitud.

28. El método de la reivindicación 26, en el que el nucleótido de bloqueo es uno de desoxicitinina o de timidina.

29. El método de la reivindicación 26, en el que el colorante de indocarbocianina y el enlazador juntos son una Nhidroxipropil, N1-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonocarbocianina.

30. El método de la reivindicación 22, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es unenlace fosforotioato.

31. El método de la reivindicación 22, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' es unenlace fosforotioato.

32. El método de la reivindicación 22, en el que

a) el hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5' está unido a un sustituyente de bloqueo en 5'; y

b) el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es un enlace fosforotioato.

33. El método de la reivindicación 32, en el que el sustituyente de bloqueo en 5' es un colorante de indocarbocianina N1-hidroxialquilo sustituido y 3,3,3',3'-tetra sustituido, que está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5'.

34. El método de la reivindicación 1, en el que la célula animal se selecciona entre el grupo constituido por una célula de mamífero, una célula de ave, una célula de insecto, una célula de gusano y una célula de pez.

35. El método de la reivindicación 17 ó 20, en el que la célula animal se selecciona entre el grupo constituido poruna célula de mamífero, una célula de ave, una célula de insecto, una célula de gusano y una célula de pez.

36. Un método de obtención de una célula bacteriana que contiene un cambio genético predeterminado en un gendiana, que comprende:

a) introducir un compuesto en una población de células bacterianas;

en el que dicho compuesto comprende un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5', que tiene al menos 15 desoxinucleótidos y no más de 35desoxinucleótidos y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones, cada una de al menos 7desoxinucleótidos que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen fijado como diana, regiones que juntas tienen al menos 14 nucleótidos de longitud, y son complementarias a la cadena codificante o a la no codificante del gen fijado como diana y regiones que están separadas por al menos unnucleótido en la secuencia del gen fijado como diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido de cadenasencilla o en ambas, codificando dicho al menos un nucleótido el cambio genético predeterminado; en el queel oligodesoxinucleótido tiene una modificación seleccionada entre el grupo constituido por:

1) el hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5' está unido a un sustituyente de bloqueo en 5',

2) el hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3' está unido a un sustituyente de bloqueo en 3',

3) el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' se sustituye por un enlace no hidrolizable, o

4) el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' se sustituye por un enlace no hidrolizable; y

b) identificar una célula de la población que tiene el cambio genético predeterminado.

37. El método de la reivindicación 36, que comprende además aislar a la célula identificada.

38. El método de la reivindicación 36, en el que el gen fijado como diana está en un cromosoma artificial bacteriano.

39. El método de la reivindicación 36, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5' es unenlace fosforotioato, o en el que un colorante de indocarbocianina N1-hidroxialquilo sustituido y 3,3,3',3'-tetra sustituido,está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5' del nucleótido del extremo 5'.

40. El método de la reivindicación 36 ó 39, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3' es un enlace fosforotioato, o en el que un nucleótido de desoxicitidina o de timidina esta unido en 3'-3' al hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3'.

41. El método de la reivindicación 36, en el que el sustituyente de bloqueo en 5' es N-hidroxipropil, N1fosfatidilpropil 3,3,3',3'.tetrametil indomonocarbocianina.

42. El método de la reivindicación 36, en el que el sustituyente de bloqueo en 3' es una desoxicitidina unida en 3'3'.

43. El método de la reivindicación 36, en el que el enlace internucleotídico no hidrolizable unido al nucleótido delextremo 5' es un enlace fosforotioato.

44. El método de la reivindicación 36, en el que el enlace internucleotídico no hidrolizable unido al nucleótido del

extremo 5' es un enlace fosforamidato.

45. El método de la reivindicación 36, en el que el enlace internucleotídico no hidrolizable unido al nucleótido delextremo 3' es un enlace fosforotioato.

46. El método de la reivindicación 36, en el que el enlace internucleotídico no hidrolizable unido al nucleótido delextremo 3' es un enlace fosforamidato.