Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas.

Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora

, presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:**Fórmula**

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución T430A, T430E, T430F, T430G, T430H, T430I, T430K, T430M, T430N, T430Q, T430R o T430V en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12164788.

Solicitante: DANISCO US INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: AEHLE, WOLFGANG, BOTT, RICHARD, R., NIKOLAEV,IGOR, SCHEFFERS,Martijn, VAN SOLINGEN,PIET, VROEMEN,CASPER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/56 (que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/24 (actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/37 (de hongos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/34 (Glucoamilasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/885 (Trichoderma)

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Fragmento de la descripción:

Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a variantes de una glucoamilasa precursora que presentan propiedades modificadas (p. ej., termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas) . En concreto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden las glucoamilasas variantes, entre las que se incluyen composiciones hidrolizantes de almidón, composiciones de pienso animal y composiciones de limpieza. La invención también hace referencia a construcciones de ADN que codifican las variantes y a métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1, 4-α-glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos o polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej.,

amilosa y amilopectina) .

Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesantes, y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529-544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 -1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. 20 Chem. 53:923 -929; patente estadounidense 5.024.941; patente estadounidense 4.794.175 y WO 88/09795) ; Talaromyces (patente estadounidense 4.247.637; patente estadounidense 6.255.084 y patente estadounidense 6.620.924) ; Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957 -964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32:129 -133 y patente estadounidense 4.863.864) ; Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense 4.618.579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:210 -217) .

Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto 30 contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa) ; cristalizada; o utilizada en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanodiol) . El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de material que contiene celulosa y/o almidón puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

WO 2006/060062 expone la glucoamilasa Trichoderma reesei TrGA y los usos en conversión de almidón, pienso animal y fermentación de alcohol.

Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora, presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de 45 aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

presentando dicha variante solo una, dos, tres o cuatro sustituciones comparada con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución T430A, T430E, T430F, T430G, T430H, T430I, T430K, T430M, T430N, T430Q, T430R o T430V en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunos casos, la variante de glucoamilasa es una variante de una glucoamilasa precursora que presenta al menos un 97 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

En algunos casos, dicha variante presenta únicamente dos, tres o cuatro sustituciones comparada con dicha precursora, sustituciones adicionales que se eligen de entre sustituciones en una posición correspondiente 10 a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 53, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263. 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 417, 418, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunos casos, la variante presenta actividad específica aumentada comparada con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

En algunos casos, la variante presenta termoestabilidad aumentada comparada con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

En algunos casos, la variante presenta actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada comparada con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

En algunos casos, la glucoamilasa precursora se obtiene a partir de una Trichoderma spp.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la variante del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende un polinucleótido del segundo aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa del primer aspecto de la invención.

En algunos casos, la composición es adecuada para utilizarse en un proceso de conversión de almidón, 30 una composición de pienso animal o un proceso de fermentación de sustrato con almidón.

En algunos casos, la composición comprende además un alfa amilasa.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una glucoamilasa variantes en una célula huésped que comprende:

la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido del

segundo aspecto de la invención y el cultivo de la célula huésped en las condiciones adecuadas para la expresión y producción de dicha variante de glucoamilasa y la producción de dicha variante.

En algunos casos, el método comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa de dicho cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La fig. 1A ilustra una glucoamilasa Trichoderma reesei (TrGA) que presenta 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) El péptido señal se subraya, la región catalítica (SEQ ID NO:3) que comienza con los residuos de aminoácidos SVDDFI (SEQ ID NO:12) y que presenta 453 residuos de aminoácidos está en negrita; la región de enlace está en cursiva y el dominio de unión a almidón (SBD) está tanto en cursiva como... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora, presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución T430A, T430E, T430F, T430G, T430H, T430I, T430K, T430M, T430N, T430Q, T430R o T430V en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

2. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha glucoamilasa precursora presenta al menos un 97 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

3. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante presenta únicamente dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, sustituciones adicionales que se 15 eligen de sustituciones en una posición correspondiente a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263, 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 417, 418, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o

una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

4. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

5. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta termoestabilidad 25 aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

6. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante presenta actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

7. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa precursora se 30 obtiene a partir de una Trichoderma spp.

8. Un polinucleótido que codifica la variante de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la composición es adecuada para

utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una composición de pienso animal o un proceso de fermentación de sustrato que contiene almidón.

12. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un alfa-amilasa.

13. Un método para producir una glucoamilasa variante en una célula huésped que comprende:

la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 y el cultivo de la célula huésped con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de dicha variante de glucoamilasa y la producción de dicha variante.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa de dicho cultivo.

Dibujos