Vacuna de células T.

Un método para preparar una vacuna de células T, que comprende:

(a) proporcionar una muestra que comprende células T aisladas de un paciente;

(b) añadir mezclas peptídicas que comprenden cada una diferentes péptidos a una pluralidad de porciones de la muestra, en donde cada péptido diferente en la mezcla peptídica es de 8-20 aminoácidos y comprende una secuencia solapante de 4-19 aminoácidos con otro péptido diferente de la mezcla peptídica; y en donde las secuencias de diferentes péptidos en las mezclas peptídicas comprenden colectivamente la secuencia completa de un antígeno polipeptídico; e

(c) identificar una parte de la muestra que comprende células T autorreactivas activadas,

en donde una mezcla peptídica que activa las células autorreactivas identificadas por (c) con un índice de estimulación por encima de un valor predeterminado es una mezcla peptídica específica de un paciente;

(d) proporcionar una muestra adicional que comprende células T aisladas del paciente;

(e) poner en contacto las células T con las mezclas peptídicas específicas del paciente identificadas en las etapas (a) a (c), por lo que las células T autorreactivas se activan;

(f) expandir las células T autorreactivas activadas; y

(g) atenuar las células T autorreactivas, de forma que las células T sean incompetentes para la replicación pero aún viables;

en donde el índice de estimulación para cada mezcla peptídica se calcula comparando la incorporación de [3H] timidina en una muestra de células T del paciente cultivadas en presencia de una mezcla peptídica que comprende una parte del polipéptido, con la incorporación de [3H] timidina en una muestra de células T cultivadas solo en un medio de control, que se expresa como el cociente de los recuentos medios por minuto de alícuotas de antígeno/recuentos medios por minuto de las alícuotas de control, en donde el valor predeterminado es de al menos 1,3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/068304.

Solicitante: Opexa Therapeutics.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2635 N. CRESCENT RIDGE DR. THE WOODLANDS TX 77381 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WILLIAMS,JIM C, MONTGOMERY,MITZI M, NEWSOM,BRIAN S.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0783 (Células T; Células NK; Progenitores de células T o NK)
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Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Vacuna de células T

Campo de la invención La presente invención se refiere a vacunas de células T y métodos para preparar estas vacunas. Las vacunas de células T se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunitarias, tales como la esclerosis múltiple.

Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria caracterizada por la destrucción de mielina en el sistema nervioso central (SNC). Cada vez más pruebas implican a las respuestas autoinmunitarias de células T contra antígenos de la mielina tales como la proteína básica de mielina (MBP), glucoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG) y proteína proteolipídica de mielina (PLP) en la patogénesis de la enfermedad (Stinissen et al., Crit. Rev. Immunol. 1997; 17:33-75). La activación y expansión clónica de las células T reactivas a mielina, seguidas por su entrada en el SNC a través de la barrera hematoencefálica, da como resultado una lesión en la membrana de mielina. Se ha descubierto que las células T reactivas a MBP se someten a una activación in vivo y se produce con una alta frecuencia del precursor de la sangre y líquido cefalorraquídeo de los pacientes con MS (Zhang et al., J.

Exp. Med., 1994; 179:973-984; Chou et al., J. Neuroimmunol., 1992; 38:105-114: Allegretta et al., Science, 1990; 247:718-721). Las estrategias recientes para combatir la enfermedad se han enfocado en la disminución del número de células T activadas reactivas a mielina, por un procedimiento denominado vacunación con células T. Las inoculaciones repetidas de células T reactivas a MBP que se han inactivado por un tratamiento químico o por radiación han demostrado que previenen o curan la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal de MS (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol., 1981; 11:195-204). La vacunación con células T ha avanzado a ensayos clínicos en pacientes con MS. En un ensayo clínico piloto, tres inoculaciones subcutáneas con células T reactivas a MBP radiadas inducían respuestas de células T que reducían el número de células T reactivas a MBP circulantes a niveles indetectables en varios sujetos (Zhang et al., Science, 1993; 261:1451-1454, Medear et al., Lancet 1995; 346:807-808). En consecuencia, los pacientes a los que se administró la vacuna demostraban una mejoría clínica que se evidenciaba como una reducción en la tasa de recaída y actividad lesional de MRI. El perfil de seguridad y viabilidad tecnológica del ensayo clínico piloto fueron excelentes. Los pacientes tenían mejorías en los parámetros físicos subjetivos y fisiológicos, y en la Escala del Estatus de Discapacidad Expandida de Kurtzke (EDSS), que es una medida objetiva de la discapacidad física de un paciente.

La estrategia inicial de vacunación con células T utilizaba MBP de longitud completa para identificar los epítopos autorreactivos. La vacunación con células T autorreactivas inactivadas producida utilizando este método se creyó inicialmente que era suficiente para tratar la MS. Sin embargo, estudios posteriores han revelado que un tiempo después de la vacunación, reaparecían las células T reactivas al antígeno de mielina. (Zhang et al.). Estas células T reactivas al antígeno de mielina frecuentemente presentaban un perfil de reactividad diferente que las que se identificaron inicialmente, un proceso denominado cambio de epítopo. Los epítopos reconocidos por las células T que reaparecían eran a menudo epítopos crípticos, no accesibles para el sistema inmunitario en el polipéptido de longitud completa y que representaban un cambio de inmunodominancia.

Las estrategias posteriores de vacunación con células T se basaban en el uso de epítopos de antígeno de mielina inmunodominantes para identificar células T autorreactivas de un determinado paciente de MS. Las características estructurales de las interacciones entre TCR-MHC clase II y/o I - péptido, dan lugar a la respuesta de células T dirigidas hacia los epítopos dominantes. Aunque la base molecular de la inmunodominancia está relacionada con la afinidad del péptido al MHC, las células T reconocen un complejo de fragmentos de antígenos que se asocian con el MHC en las células presentadoras de antígeno (APC). La inmunodominancia se considera que es un número relativamente alto (o frecuencia) de células T específicas de antígeno que alcanzan un umbral de activación (por ejemplo, un índice de estimulación) en respuesta a un antígeno en particular. La inmunodominancia se utiliza variablemente para describir o bien la respuesta detectable más frecuentemente entre los individuos que se ensayan o la respuesta más fuerte en un único individuo, ya que los factores determinantes de la inmunodominancia inter- individuos o la intra-individuo todavía se entienden poco. La inmunodominancia es una característica central de las respuestas de las células T a los antígenos. De los muchos péptidos presentes en el complejo de antígenos, las respuestas a los péptidos se pueden ordenar basándose en el número y/o la actividad de células T que responden, en una jerarquía relativamente estable. A pesar de su importancia para entender las respuestas inmunitarias y diseñar vacunas, la inmunodominancia se entiende poco a nivel de su mecanismo. La inmunodominancia no se explica simplemente por el número de complejos peptídicos que generan las células presentadoras de antígeno (APC), las afinidades de los péptidos por las moléculas de clase I o la clase II, o las afinidades de los receptores de células T para los complejos peptídicos de clase I o clase II, aunque cada uno de estos parámetros contribuyen al fenómeno.

La utilización de los epítopos inmunodominantes en la producción de una vacuna de células T se basó en el reconocimiento ya que, aunque las respuestas de las células T a los antígenos de mielina son heterogéneas en el reconocimiento de epítopos entre los diferentes individuos, ciertas regiones de antígenos de mielina, tales como los restos 83-99 y 151-170 de MBP, se reconocen preferentemente en algunos pacientes con MS. (Ota et al., Nature, 1990; 346:183-187). Las células T autólogas reactivas a los péptidos inmunodominantes se expandieron e inactivaron, después se inyectaron a pacientes a partir de los cuales se habían aislado. Aunque esta estrategia dio lugar a un descenso en la tasa de progresión de la enfermedad, el curso de la enfermedad de los pacientes continuaba progresando. Por lo tanto, existe la necesidad de vacunas de células T mejoradas.

Achiron et al., Clin. Immunology, 2004, desvelan la inmunización de pacientes de esclerosis múltiple con líneas de células T atenuadas que se activaron con péptidos sintéticos de MBP (aminoácidos 83-99, 87-110 y 151-170) y MOG (aminoácidos 6-26 y 34-56). La vacunación con células T presentaba efectos clínicos beneficiosos en los pacientes vacunados.

La nota de prensa de PharmaFrontiers presenta el Tovaxin, que es una formulación trivalente de células T atenuadas reactivas a péptidos contra MBP, PLP y MOG. Se utilizaron dos péptidos de cada una de MBP, PLP y MOG para la producción de la vacuna. El tratamiento con Tovaxin agotaba las células T reactivas a péptidos de mielina con esclerosis múltiple. (http://www.msmusings.com/archive70/74/FYI, %20two %20articles %20tovaxin.htm)

Sumario de la invención La presente invención se expone en las reivindicaciones.

Se desvela un método para identificar un epítopo en un antígeno polipeptídico para una célula T autorreactiva. Se puede proporcionar una muestra que comprende células T aisladas de un huésped. Se puede añadir uno o más péptidos diferentes a una pluralidad de partes de la muestra. Las secuencias de los péptidos pueden comprender colectivamente una parte de la secuencia del antígeno polipeptídico. Se puede identificar una parte de la muestra que comprende las células T autorreactivas activadas. Un péptido que activa las células T autorreactivas puede comprender el epítopo. Las secuencias de los péptidos comprenden colectivamente la secuencia del antígeno polipeptídico. El antígeno polipeptídico puede ser MBP, PLP, MOG o una combinación de los mismos. Los diferentes péptidos comprenden una secuencia que se solapa 4-19 aminoácidos. Los diferentes péptidos tienen 8-20 aminoácidos. El número de células T autorreactivas estimuladas puede aumentar al menos en un factor de aproximadamente 2 a 4 en comparación con un control. Se proporciona un método para preparar una vacuna de células T como se expone en la reivindicación 1. Se proporciona una muestra que comprende células T aisladas de un paciente. Las células T se ponen en contacto con una o más mezclas de péptidos diferentes que activan las células T autorreactivas. Las células T autorreactivas activadas se expanden. Entonces, las células T autorreactivas se atenúan. Los diferentes péptidos estimulan las células T autorreactivas con un índice de estimulación por encima de un valor predeterminado. Los polipéptidos antigénicos son MBP, PLP y MOG.

Se desvela también un método de detección del cambio de epítopo en una enfermedad mediada por células T. Se pueden identificar los epítopos de un antígeno autorreactivo, como se ha descrito anteriormente. Los epítopos se pueden comparar con un control. El cambio de epítopo se puede producir si los epítopos son diferentes. La detección del cambio de epítopo se puede utilizar para diagnosticar el cambio de epítopo en un sujeto. La detección del cambio de epítopo se puede utilizar también para controlar el cambio de epítopo en un sujeto comparando los epítopos con epítopos en un momento previo. También se desvela una vacuna de células T. La vacuna comprende células T que son específicas de un polipéptido antigénico. La vacuna comprende células T que reconocen cada epítopo de los polipéptidos antigénicos capaces de producir un índice de estimulación por encima de un valor predeterminado. Los polipéptidos antigénicos son MBP, PLP y MOG. La vacuna puede comprender menos del 50 % de células T que reconocen los epítopos del polipéptido antigénico capaz de producir un índice de estimulación menor que un valor predeterminado. Las células T pueden comprender marcadores celulares que incluyen, pero no se limitan a, CD3, CD4, CD8, CD25, TCR αβ, TCR γδ, HSP60 (proteína 60 del choque térmico) o una combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un análisis EAA de reactividad de células T de un paciente a mezclas de péptidos MOG. La Figura 2 muestra las frecuencias de reactividad a mezclas del péptido MBP entre las células T de 48 sujetos. La Figura 3 muestra las frecuencias de reactividad a mezclas del péptido PLP entre células T de 48 sujetos.

La Figura 4 muestra las frecuencias de reactividad a mezclas del péptido MOG entre células T de 48 sujetos. La Figura 5 muestra las predicciones de unión ProPred con la proteína MOG para los 3 alelos HLA del paciente.

Los restos de aminoácidos rojos representan los restos ancla previstos para la unión con el surco HLA, mientras que los restos amarillos representan los otros restos que se ajustarían en el surco. La Figura 6 muestra el análisis EAA de reactividad de las células T de un paciente a mezclas de péptido MBP. La Figura 7 muestra el porcentaje de expresión de cadenas TCR V beta en la línea base y tras 18 días de estimulación con péptido MBPm10 utilizando células T de un paciente. La Figura 8 muestra el análisis EAA de reactividad de las células T de un paciente a mezclas de péptidos de mielina. La Figura 9 muestra el cultivo de células T que presentan una fuerte reactividad contra dos péptidos de mielina por análisis EAA como se muestra en la Figura 8.

La Figura 10 muestra el enfoque en TCR V beta que se produce en una línea de células T de un paciente según progresa el cultivo desde el Día 9 al Día 16 mientras se estimulan con la mezcla del péptido PLPm27. La Figura 11 muestra algunos datos de frecuencia de células T reactivas a la mielina de un paciente que se ha sometido a una primera serie de retratamiento de tres vacunas de células T reactivas a la mielina. La Figura 12 muestra la reactividad de las células T de un paciente la Semana 24 a los péptidos que abarcan el MBP de longitud completa. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos que contienen las dos secuencias MBP inmunodominantes que se utilizaron previamente en el análisis de frecuencia de células T (TCFA). La Figura 13 muestra la reactividad de células T de un paciente la Semana 24 a los péptidos que abarcan el PLP de longitud completa. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos que contienen las dos secuencias PLP inmunodominantes que se utilizaron previamente en el TCFA. La Figura 14 muestra la reactividad de células T de un paciente la Semana 24 a los péptidos que abarcan el MOG de longitud completa. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos que contienen las dos secuencias MOG inmunodominantes que se utilizaron previamente en el TCFA. La Figura 15 muestra el patrón de reactividad de los péptidos MBP en ocho pacientes. La línea roja horizontal muestra el corte SI de 3. Los cuadros alrededor de la barras indican los péptidos inmunodominantes que se utilizaron previamente. La Figura 16 muestra el patrón de reactividad de los péptidos PLP en ocho pacientes. La línea roja horizontal muestra el corte SI de 3. Los cuadros alrededor de la barras indican los péptidos inmunodominantes que se utilizaron previamente.

La Figura 17 muestra el patrón de reactividad de los péptidos MOG en ocho pacientes. La línea roja horizontal muestra el corte SI de 3. Los cuadros alrededor de la barras indican los péptidos inmunodominantes que se utilizaron previamente. La Figura 18 muestra la media de los SI contra MBP para las muestras de un total de 15 pacientes con MS ensayados utilizando el EAA. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos inmunodominantes.

La Figura 19 muestra la media de los SI contra PLP para las muestras de un total de 15 pacientes con MS ensayados utilizando el EAA. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos inmunodominantes. La Figura 20 muestra la media de los SI contra MOG para las muestras de un total de 15 pacientes con MS ensayados utilizando el EAA. Los cuadros alrededor de las barras indican los péptidos inmunodominantes. La Figura 21 muestra la frecuencia de reactividad de péptidos MBP entre 54 sujetos. Los sujetos estaban sanos (“Norm”), solo se les extrajo sangre (“MD”), se inscribieron en un estudio de vacunación repetida (“Ext”), o se inscribieron en un estudio de escalado de dosis (“DES”). Los cuadros alrededor de las barras indican las localizaciones de los péptidos inmunodominantes que se utilizaron en la producción de la vacuna del Ejemplo 1. La Figura 22 muestra la frecuencia de reactividad de péptidos PLP entre 54 sujetos. Los sujetos estaban sanos (“Norm”), solo se les extrajo sangre (“MD”), se inscribieron en un estudio de vacunación repetida (“Ext”), o se inscribieron en un estudio de escalado de dosis (“DES”). Los cuadros alrededor de las barras indican las localizaciones de los péptidos inmunodominantes que se utilizaron en la producción de la vacuna del Ejemplo 1. La Figura 23 muestra la frecuencia de reactividad de péptidos MOG entre 54 sujetos. Los sujetos estaban sanos (“Norm”), solo se les extrajo sangre (“MD”), se inscribieron en un estudio de vacunación repetida (“Ext”), o se inscribieron en un estudio de escalado de dosis (“DES”). Los cuadros alrededor de las barras indican las localizaciones de los péptidos inmunodominantes que se utilizaron en la producción de la vacuna del Ejemplo 1. La Figura 24 muestra las curvas de crecimiento de cinco células T reactivas a la mielina que habían presentado un índice de estimulación de menos de 2,0. Las células T se aislaron de dos pacientes. Las Figuras 25A-H muestran un mapa de 429 ensayos (ensayos únicos en las filas y los péptidos en las columnas). Los ensayos de cada paciente se enumeran en el orden de la fecha en que se realizaron. Las mezclas de polipéptidos positivas se muestran en gris. La Figura 26 muestra un mapa de 65 ensayos (ensayos únicos en las filas y los péptidos en las columnas). Los ensayos de cada paciente se enumeran en el orden de la fecha en que se realizaron. Las mezclas de polipéptidos positivas se muestran en gris. La Figura 27 muestra el cambio de epítopo a lo largo del tiempo en cuatro sujetos.

Descripción detallada Se desvela una vacuna de células T que comprende células T específicas para epítopos de un polipéptido antigénico. También se desvelan métodos de identificación de tales epítopos y métodos para preparar tal vacuna. La vacuna puede ser una vacuna personalizada. Otros aspectos se volverán aparentes para el experto en la técnica por medio de la siguiente descripción.

1. Definiciones. La terminología en el presente documento solamente se utiliza con el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante. Como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen los referentes plurales a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa. “Péptido” o “polipéptido” puede significar una secuencia de aminoácidos unidos y puede ser natural, sintético o una modificación o combinación de aminoácidos naturales y sintéticos.

“Tratamiento” o “tratar”, cuando se refiere a la protección de un animal de una enfermedad, puede significar evitar, suprimir, reprimir, o eliminar completamente la enfermedad. Prevenir la enfermedad implica la administración de una composición de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. Suprimir la enfermedad implica la administración de una composición de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad pero antes de su aparición clínica. Reprimir la enfermedad implica la administración de una composición de la presente invención a un animal después de la aparición clínica de la enfermedad. a. sustancialmente idéntico “Sustancialmente idéntico” que se utiliza en el presente documento puede significar que una primera y segunda secuencias son al menos idénticas en un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más aminoácidos. 2. Respuesta inmunitaria de células T

Con el fin de iniciar una respuesta inmunitaria específica contra una célula T reactiva a la mielina (MRTC), el sistema inmunitario tiene que ser capaz de identificar las células T autorreactivas implicadas en la patogénesis y asilar productos proteicos particulares que perfeccionarán los esfuerzos de defensa del huésped. En este modelo está implícito el procesamiento de un epítopo peptídico y su presentación en la superficie de células presentadoras de antígeno. El resultado de estas acciones es la inducción de una respuesta de células T que recluta e implica los otros participantes moleculares de la respuesta inmunitaria. Como elemento central de este sistema inmunitario está el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Localizado en el cromosoma 6 humano, el MHC es un grupo altamente polimórfico de genes que codifican moléculas esenciales para la auto/no auto discriminación y procesamiento y presentación de antígenos. La fuerza de este complejo multigenético descansa en su polimorfismo, que posibilita productos alélicos diferentes clase I y clase II que se unen a una matriz casi infinita de péptidos. La naturaleza del MHC sugiere el actual concepto fundamental de auto restricción de MHC. Las células T CD4+ se activan por las células presentadoras de antígeno que comparten alelos MHC clase II con ellas; es decir, el reconocimiento del antígeno por las células T CD4+ auxiliares (Th) está restringido al MHC clase II. El reconocimiento de antígenos por células T CD8+ citotóxicas (Tc), por otra parte, está restringido al MHC clase I.

Un dogma central de la respuesta inmunitaria de células T es la presentación del péptido por el antígeno leucocitario humano (HLA, también conocido como el MHC). Las moléculas de HLA están presentes en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC). Estas moléculas HLA (de las que hay cientos de alelos diferentes) constituyen el fenotipo HLA de un paciente. Un péptido que se va a presentar a una célula T debe unirse específicamente en la ranura de MHC I o II creada por la molécula HLA. Como se ha tratado anteriormente, las vacunas de células T que se producen utilizando proteínas antigénicas de longitud completa no eran satisfactorias. Los antígenos de longitud completa son dependientes de un procesamiento en las APC con el fin de que el péptido apropiado se presente por el HLA. El procesamiento incompleto disminuye la capacidad del HLA para presentar los epítopos relevantes de la enfermedad. El intento inicial para superar el problema del procesamiento de antígenos de longitud completa era producir mejor la vacuna utilizando péptidos. Con el fin de determinar qué péptidos eran el antígeno estimulante apropiado, se llevaron a cabo exploraciones en pacientes con MS para identificar los epítopos inmunodominantes. Estos epítopos inmunodominantes en realidad cubren aún una parte menor de la reactividad completa entre los individuos con MS. Se proporciona en el presente documento un método para detectar los péptidos inmunorreactivos verdaderamente específicos individualmente (relevantes para la enfermedad) en cada individuo. El método también se puede utilizar para rastrear estas células idiotípicas. El método se puede utilizar también para detectar nuevos idiotipos patogénicos según aparecen y controlar la persistencia de la supresión de otros.

A pesar de que puede haber péptidos adicionales relevantes de la enfermedad para un paciente determinado, el uso de epítopos inmunodominantes se consideró que era suficiente debido a que la vacunación de un paciente con tal vacuna daría lugar a una respuesta inmunitaria anti-idiotípica y anti-ergotípica. Se creyó que la respuesta idiotípica se dirigía a la población de células T específicas de la vacuna, mientras que se creyó que la respuesta anti- ergotípica se dirigía a todas las poblaciones de células T activadas.

Utilizando el mismo grupo de péptidos para cada paciente no se tiene en consideración el fenotipo HLA individual y por lo tanto la unión del péptido a su APC no se optimiza. El uso solamente de péptidos inmunodominantes da lugar frecuentemente a cultivos con crecimiento pobre ya que las células T no se estimulan óptimamente por tales péptidos. Cuando se conocen los alelos HLA, la producción de una vacuna de células T que utiliza péptidos que son capaces de unirse al HLA del paciente generalmente da lugar a la producción de una vacuna robusta. Para los alelos HLA que no se conocen, sin embargo, los péptidos que se unen no se pueden prever y por lo tanto se tienen que utilizar en un ensayo de exploración para producir una respuesta robusta. Además, incluso para los alelos conocidos, el modelo de predicción no es un 100 % preciso. Por lo tanto la estrategia EAA descrita en el presente documento puede también limitar el efecto de la diseminación del epítopo a péptidos adicionales de las proteínas mielínicas. La vacuna de células T que se proporcionan en el presente documento se pueden individualizar para cualquier paciente determinado basándose en la variabilidad y promiscuidad de los receptores de células T autorreactivas entre los pacientes. 3. Análisis de Exploración de Epítopos (EAA)

Se desvela un método de identificación de un epítopo de un polipéptido autorreactivo. Se proporciona una muestra que comprende células T aisladas de un huésped. Por ejemplo, se pueden recolectar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células mononucleares del líquido cefalorraquídeo (CSFMC) de un huésped. La muestra se puede entonces dividir en una pluralidad de partes, cada una de las cuales se puede incubar en presencia de uno o más péptidos diferentes o un control. Las secuencias de los péptidos comprenden colectivamente la secuencia completa del antígeno polipeptídico. Finalmente, se puede identificar una muestra que comprenda células T autorreactivas estimuladas. La parte de la muestra que comprende células T autorreactivas estimuladas se puede identificar en referencia a un índice de estimulación (SI).

El EAA puede dar como resultado el crecimiento de ambas CD4 (MHC II) y CD8 (MHC I). Originalmente, se creía que las células Th1 CD4 clase II eran las únicas células patógenas en MS; sin embargo, se ha vuelto evidente que las células CTL CD8 clase I están fuertemente asociadas a la MS. Algunos han descrito que los loci MHC II son los enlaces genéticos predominantes y otros han demostrado que en el fondo de los loci MHC II hay una fuerte asociación con ciertos loci MHC I en la MS y las formas de MS más graves. Las metodologías predictivas anteriores no identificaban los péptidos a través de ambos MHC II y I. El EAA identifica estos péptidos sin la necesidad de saber las relaciones entre MHC II y I. Además, el EAA puede utilizar un péptido de longitud suficiente para adecuar la vacuna al paciente. Las APC pueden procesar un péptido para producir un péptido de 10 a 11 aminoácidos que es presentado por el MHC clase II. Los péptidos pueden someterse a una proteolisis parcial que produce una secuencia que se puede unir a MHC clase I, que puede tener aproximadamente 9 aminoácidos de longitud. Como resultado, las células T CD4 y CD8 pueden crecer utilizando un péptido adecuado aunque el MHC I y el MHC II estén asociados con la MS en un paciente particular. a. Péptidos

Los péptidos que comprenden una parte de cualquier polipéptido autorreactivo se pueden utilizar en el método de exploración. Los péptidos pueden comprender una parte de polipéptidos autorreactivos asociados a la MS tales como MBP (número de registro NCBI P02686, o un polipéptido sustancialmente idéntico a éste), MOG (número de registro NCBI CAA52617, o un polipéptido sustancialmente a éste), PLP (número de registro NCBI AAA60350, o un polipéptido sustancialmente idéntico a éste), o una combinación de los mismos. Las secuencias de los péptidos pueden comprender colectivamente la secuencia completa del antígeno polipeptídico. Los diferentes péptidos comprenden una secuencia que se solapa 4 a 19 aminoácidos. Los péptidos tienen de 8 a 20 aminoácidos. b. Índice de estimulación

El SI se puede calcular comparando la incorporación de [3H] timidina de la muestra en presencia de un péptido que comprende una parte de un polipéptido diana de MRTC con respecto a la de solamente en presencia de un medio de control. En breve, se colocan en placas y se incuban por separado alícuotas de la muestra en presencia de o un péptido que comprende una parte del polipéptido o solo un medio de control con el fin de estimular las células T reactivas. Los cultivos se pulsan con [3H] timidina durante las últimas 6-18 horas de incubación. El SI se calcula como el cociente de la media de recuentos por minuto (cpm) de las alícuotas de antígeno/la media de cpm de las alícuotas de control. El SI de las células T autorreactivas puede aumentar en al menos un factor de 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, o 4,0 en comparación con un control.

(1) Valor predeterminado El valor predeterminado de SI puede ser 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, o 4,0.

El valor predeterminado también se puede calcular utilizando un Método de Evaluación de Varianza de la siguiente manera: 1. Se pueden ejecutar los EAA en una población de pacientes determinada (un mínimo de 120 ensayos de 120 sujetos únicos) 2. Se puede crear una “población negativa” promediando todos los valores de SI < 2,5 3. Se puede calcular la Desviación Estándar (SD) para cada péptido 4. Se puede calcular entonces lo siguiente para cada péptido: a. La media + 1 SD b. La media + 2 SD c. La media + 3 SD 5. Se pueden considerar los siguientes SI por encima del valor predeterminado: a. SI mayor o igual a la media + 3 SD b. Cualquier SI mayor o igual a 2,5 El SI se puede calcular también ensayando cada pocillo en vez de promediar los pocillos que se lleva a cabo por triplicado. En este caso, en cada pocillo único que cumple los criterios anteriores puede considerarse que el ensayo está por encima del valor predeterminado.

El valor predeterminado también se puede evaluar utilizando el Método de la Varianza de Recuentos por Minuto (CPM). Este algoritmo puede fijar un punto de corte amplio para todos los péptidos en un ensayo determinado. Se puede calcular de la siguiente manera: 1. Los EAA se pueden ejecutar y se puede promediar el CPM para todos los pocillos de control (solo el medio, sin antígeno). 2. Se puede entonces calcular la SD de los pocillos de control. 3. Se puede entonces calcular lo siguiente para los pocillos de control: a. La media + 1 SD b. La media + 2 SD c. La media + 3 SD 4. Cualquier péptido con un CPM medio mayor o igual a la media + 3 SD de los pocillos de control, se puede considerar por encima del valor predeterminado.

Se puede también evaluar cada pocillo en vez de la media de pocillos por triplicado, En este caso, en cada pocillo único que cumple con los criterios se puede considerar que el ensayo está por encima del valor predeterminado. Cualquier péptido, que se analiza o en un pocillo individual o como la media de los pocillos ejecutado por triplicado, con un SI ≥ 2,5, un SI ≥ media + 3 SD por el Método de Evaluación de la Varianza, o un SI ≥ media + 3 SD por el método de la varianza CPM se puede considerar por encima del valor predeterminado, lo que indica una célula(s) T positiva en cuanto a la reactividad contra un péptido. 4. Método de fabricación de una vacuna de células T

Se desvela un método de preparación de una vacuna de células T. Se puede proporcionar una muestra que comprende células T aisladas de un paciente. Se puede entonces añadir un péptido que comprende un epítopo identificado por el método de exploración. Se pueden aislar entonces las células T autorreactivas. Las células T entonces se pueden atenuar.

a. Estimulación Las células T autólogas que se identificaron como que tenían un SI por encima de un valor predeterminado en cuanto a un péptido que comprende un epítopo identificado por el método de exploración se puede someter a ciclos de estimulación recurrentes con el péptido correspondiente, y opcionalmente IL-2, en presencia de APC tal como las PBMC autólogas irradiadas. La radiación puede ser a 3500 o 2500-7000 rad. Los ciclos de estimulación se pueden llevar a cabo durante 7-10 días. Las células T se pueden propagar en ciclos de estimulación hasta que el número total de células alcanza un nivel terapéutico. Las líneas celulares T se pueden crioconservar en este punto.

Las células T se pueden activar por estimulación no específica para inducir la regulación positiva de ergótopos. Las células T activadas resultantes entonces se pueden atenuar. Las células T se pueden atenuar por cualquier método que haga que la replicación de las células T sea incompetente aunque viable. Por ejemplo, las células T se pueden atenuar por radiación tal como radiación gamma o por inactivación química.

b. Activación Las células T autorreactivas se pueden activar durante los ciclos de cultivo de estimulación antes de la atenuación. La activación de las células T durante los ciclos de cultivo antes de la atenuación puede inducir una regulación positiva general de ergótopos que se expresan en la superficie de células T activadas pero no en reposo (Irun R. Cohen, Francisco J. Quintana, y Avishai Mimran. Tregs in T cell vaccination: exploring the regulation of regulation. JCI Volume 114 (9) 1227-1232, 2004). Por lo tanto, cuando se cultivan células T autorreactivas como células T activadas antes de la atenuación, se pueden esperar respuestas de células T tanto anti-ergotípicas como anti- idiotípicas después de la vacunación. (Cohen et al., JCI Volume 114 (9): 1227-1232, 2004). Las células T autorreactivas se pueden activar por exposición a mitógenos (tales como fitohemaglutinina (PHA)) o interleucina-2 en presencia de PHA o por medio de unión del complejo TCR/CD3 (Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170:827). Uno de los primeros mecanismos por los cuales la activación de células T puede conferir una respuesta a IL-2, es por medio de la regulación de subunidades de receptor (ergótopos) para estas citoquinas (Chua et al., J. Immunol. 153:128, 1994; Desai et al., J. Immunol. 148:3125, 1992; Presky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14002, 1997; y Wu et al., Eur. J. Immunol. 27:147, 1997). c. APC Las APC pueden ser leucocitos sanguíneos. Los ejemplos representativos de APC incluyen monocitos, células dendríticas y células B. d. Células T La vacuna de células T pueden comprender células T positivas a marcadores celulares CD3, CD4, CD8, CD25, TCR αβ, TCR γδ, HSP60 (proteína 60 del choque térmico) o una combinación de los mismos. La vacuna de células T también puede comprender membranas de células T o fragmentos de las mismas. e. Atenuación

La vacuna de células T puede estar atenuada. La atenuación puede ser por cualquier método que haga la replicación de las células T incompetente aunque viable. Por ejemplo, las células T pueden atenuarse por radiación tal como radiación gamma o por inactivación química. La radiación gamma puede ser de 10.000 o 7.000 a 12.000 rad.

5. Vacunas de células T Se desvela también una vacuna de células T. La vacuna puede producirse como se ha descrito anteriormente. La vacuna puede comprender células T que son específicas de un polipéptido antigénico que se caracteriza porque los epítopos (opcionalmente, todos los epítopos) del polipéptido antigénico capaces de producir un índice de estimulación por encima de un valor predeterminado se reconocen por las células T autorreactivas presentes en la vacuna. La vacuna puede comprender 60-90 millones, 30-45 millones, o 6-9 millones de células T. La vacuna también puede comprender menos de un 50 % de células T que reconocen los epítopos del polipéptido antigénico capaz de producir un índice de estimulación menor que el valor predeterminado. La vacuna puede comprender también menos del 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de células T que reconocen epítopos del polipéptido antigénico capaz de producir un índice de estimulación menor que un valor predeterminado. La vacuna de células T puede comprender células T que son específicas de múltiples polipéptidos antigénicos. Por ejemplo, una vacuna de células T que se va a administrar a un paciente con MS puede contener células T específicas de MBP, PLP y MOG. 6. Método de detección un cambio de epítopo Se desvela un método de detección de un cambio de epítopo en una enfermedad mediada por células T. El método comprende la identificación de los epítopos de un antígeno autorreactivo utilizando el método de exploración y comparando estos epítopos con un control. Si los epítopos son diferentes, se ha detectado un cambio de epítopo. La detección de un cambio de epítopo se puede utilizar para diagnosticar un cambio de epítopo o para controlar el cambio de epítopo.

Proporcionando péptidos que comprenden una parte de la secuencia de un antígeno polipeptídico, la invención proporciona un método de identificación de epítopos crípticos que están enmascarados en la proteína de longitud completa. La presente invención tiene múltiples aspectos, que se ilustran por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Vacunas basadas en inmunodominantes

En ensayos clínicos previos, las líneas celulares vacunales se producían estimulando los cultivos de células T con dos péptidos inmunodominantes de MBP. En los ensayos clínicos recientes, las líneas celulares vacunales se produjeron estimulando células T con un total de seis péptidos inmunodominantes (2 de MBP, 2 de PLP y 2 de MOG). Para algunos pacientes, el uso de este grupo limitado de péptidos daba como resultado cultivos de crecimiento pobre y varias semanas para producir las vacunas. Las células T no se habían estimulado óptimamente debido a que los péptidos no coincidían óptimamente con el fenotipo HLA de cada paciente. Además, no se cubría la mayoría de los epítopos implicados utilizando solo los epítopos sospechosos de ser inmunodominantes y por lo tanto no se conseguía una vacuna verdaderamente individualizada. Los epítopos que no están cubiertos pueden estar estimulando la expansión clónica y patogénesis in vivo y puede estar sin comprobar.

Ejemplo 2 Epítopos de mielina Con el fin de determinar si se podía mejorar la elección de péptidos estimulantes apropiados, se prepararon epítopos peptídicos adicionales de MBP, PLP y MOG y se ensayaron en pacientes de esclerosis múltiple. Para llevar a cabo los análisis se sintetizaron un total de 163 péptidos solapados diferentes (la síntesis de cada péptido de 16 aminoácidos (16-mero) se compensaba con 4 aminoácidos con un solapamiento de 12 aminoácidos de la secuencia previa) que cubrían la longitud completa de MBP, PLP y MOG. Se sintetizaron un total de 44 MBP, 67 PLP y 52 MOG secuencias peptídicas. La lista de secuencias, sus identificadores y el número de aminoácidos y cómo se combinaron para su uso en el EAA (ID de la Mezcla) se muestran en las Tablas 1-3. Las seis secuencias inmunodominantes que se utilizan en el Ejemplo 1 están en negrita.

Tabla 1 Secuencias de MBP ID de la Mezcla ID Sec peptídica Aminoácidos Secuencia SEC ID Nº de péptidos MBP 1 a 16 MASQKRPSQRHGSKYL 1 MBPm1 MBP 2 a 20 KRPSQRHGSKYLATAS 2 MBP 3 9 a 24 QRHGSKYLATASTMDH 3 MBPm2 MBP 4 13 a 28 SKYLATASTMDHARHG 4 MBP 5 17 a 32 ATASTMDHARHGFLPR MBPm3 MBP 6 21 a 36 TMDHARHGFLPRHRDT 6 MBP 7 a 40 ARHGFLPRHRDTGILD 7 MBPm4 MBP 8 29 a 44 FLPRHRDTGBLDSIGR 8 MBP 9 33 a 48 HRDTGILDSIGRFFGG 9 MBPm5 MBP 10 37 a 52 GILDSIGRFFGGDRGA MBP 11 41 a 56 SIGRFFGGDRGAPKRG 11 MBPm6 MBP 12 a 60 FFGGDRGAPKRGSGKV 12 MBP 13 49 a 64 DRGAPKRGSGKVPWLK 13 MBPm7 MBP 14 53 a 68 PKRGSGKVPWLKPGRS 14 MBP 15 57 a 72 SGKVPWLKPGRSPLPS MBPm8 MBP 16 61 a 76 PWLKPGRSPLPSHARS 16 MBP 17 a 80 PGRSPLPSHARSQPGL 17 MBPm9 MBP 18 69 a 84 PLPSHARSQPGLCNMY 18 MBP 19 73 a 88 HARSQPGLCNMYKDSH 19 MBPm10 MBP 20 77 a 92 QPGLCNMYKDSHHPAR MBP 21 81 a 96 CNMYKDSHHPARTAHY 21 MBPm11 MBP 22 85 a 100 KDSHHPARTAHYGSLP 22 MBP 23 89 a 104 HPARTAHYGSLPQKSH 23 MBPm12 MBP 24 93 a 108 TAHYGSLPQKSHGRTQ 24 MBP 25 97 a 112 GSLPQKSHGRTQDENP

MBPm13 MBP 26 101 a 116 QKSHGRTQDENPVVHF

26 MBP 27 105 a 120 GRTQDENPVVHFFKNI

27 MBPm14 MBP 28 109 a 124 DENPVVHFFKNIVTPR

28 MBP 29 113 a 128

VVHFFKNIVTPRTPPP 29 MBPm15 MBP 30 117 a 132

FKNIVTPRTPPPSQGK MBP 31 121 a 136

VTPRTPPPSQGGAEG 31 MBPm16 MBP 32 125 a 140

TPPPSQGGAEGQRPG 32 MBP 33 129 a 144 SQGGAEGQRPGFGYG 33 MBPm17 MBP 34 133 a 148 AEGQRPGFGYGGRAS 34 MBP 35 137 a 152 RPGFGYGGRASDYKS MBPml8 MBP 36 141 a 156 GYGGRASDYKS AHKG 36 MBP 37 145 a 160 RASDYKSAHKGFKGV 37 MBPml9 MBP 38 149 a 164 YKSAHKGFKGVDAQG 38 MBP 39 153 a 168 HKGFKGVDAQGTLSK

39 MBPm20 MBP 40 157 a 172 KG VDAQGTLSKIFKL

MBP 41 161 a 176 AQGTLSKIFKLGGRD

41 MBPm21 MBP 42 165 a 180 LSKIFKLGGRDSRSG

42 MBP 43 169 a 184

FKLGGRDSRSGSPMA

43 MBPm22 MBP 44 173 a 185

GRDSRSGSPMARR

44 Tabla 2 Secuencias de PLP ID de la Mezcla ID Sec peptídica Aminoácidos Secuencia SEC ID Nº de péptidos PLP 1 1 a 16 MGLLECCARCLVGAPF PLPm1 PLP 2 a ECCARCLVGAPFASLV 46 PLP 3 9 a 24 RCLVGAPFASLVATGL 47 PLPm2 PLP 4 13 a 28 GAPFASLVATGLCFFG 48 PLP 5 17 a 32 ASLVATGLCFFGVALF

49 PLPm3 PLP 6 21 a 36 ATGLCFFGVALFCGCG

PLP 7 a CFFGVALFCGCGHEAL

51 PLPm4 PLP 8 29 a 44 VALFCGCGHEALTGTE

52 PLP 9 33 a 48

CGCGHEALTGTEKLIE

53 PLPm5 PLP 10 37 a 52

HEALTGTEKLIETYFS

54 PLP 11 41 a 56

TGTEKLIETYFSKNYQ PLPm6 PLP 12 a

KLIETYFSKNYQDYEY 56 PLP 13 49 a 64

TYFSKNYQDYEYLINV 57 PLPm7 PLP 14 53 a 68 KNYQDYEYLINVIHAF 58 PLP 15 57 a 72 DYEYLIN VIHAFQY VI 59 PLPm8 PLP 16 61 a 76 LINVIHAFQYVIYGTA PLP 17 a 80 IHAFQYVIYGTASFFF 61 PLPm9 PLP 18 69 a 84 QYVIYGTASFFFLYGA 62 PLP 19 73 a 88 YGTASFFFLYGALLLA 63 PLPm 10 PLP 20 77 a 92 SFFFLYGALLLAEGFY 64 PLP 21 81 a 96 LYGALLLAEGFYTTGA PLPm11 PLP 22 85 a 100 LLLAEGFYTTGAVRQI 66 PLP 23 89 a 104 EGFYTTGAVRQIFGDY 67 PLPm12 PLP 24 93 a 108 TTGAVRQIFGDYKTTI 68 PLP 25 97 a 112 VRQIFGDYKTTICGKG 69 PLPm13 PLP 26 101 a 116 FGDYKTTICGKGLSAT PLP 27 105 a 120 KTTICGKGLSATVTGG 71 PLPm14 PLP 28 109 a 124 CGKGLSATVTGGQKGR 72 PLP 29 113 a 128 LSATVTGGQKGRGSRG 73 PLPm15 PLP 30 117 a 132 VTGGQKGRGSRGQHQA 74 PLP 31 121 a 136 QKGRGSRGQHQAHSLE 75 PLPm16 PLP 32 125 a 140 GSRGQHQAHSLERVCH 76 PLP 33 129 a 144 QHQAHSLERVCHCLGK 77 PLPm17 PLP 34 133 a 148 HSLERVCHCLGKWLGH 78 PLP 35 137 a 152 RVCHCLGKWLGHPDKF 79 PLPm18 PLP 36 141 a 156 CLGKWLGHPDKFVGIT 80 PLP 37 145 a 160 WLGHPDKFVGITYALT 81 PLPm19 PLP 38 149 a 164 PDKFVGITYALTVVWL 82 PLP 39 153 a 168 VGITYALTVVWLLVFA 83 PLPm20 PLP 40 157 a 172 YALTVVWLLVFACSAV 84 PLP 41 161 a 176 VVWLLVFACSAVPVYI 85 PLPm21 PLP 42 165 a 180 LVFACSAVPVYIYFNT 86 PLP 43 169 a 184 CSAVPVYIYFNTWTTC

87 PLPm22 PLP 44 173 a 188 PVYIYFNTWTTCQSIA

88 PLP 45 177 a 192 YFNTWTTCQSIAFPSK

89 PLPm23 PLP 46 181 a 196

WTTCQSIAFPSKTSAS

90 PLP 47 185 a 200

QSIAFPSKTSASIGSL

91 PLPm24 PLP 48 189 a 204

FPSKTSASIGSLCADA 92 PLP 49 193 a 208

TSASIGSLCADARMYG 93 PLPm25 PLP 50 197 a 212

IGSLCADARMYGVLPW 94 PLP 51 201 a 216 CADARMYGVLPWNAFP 95 PLPm26 PLP 52 205 a 220 RMYGVLPWNAFPGKVC 96 PLP 53 209 a 224 VLPWNAFPGKVCGSNL 97 PLPm27 PLP 54 213 a 228 NAFPGKVCGSNLLSIC 98 PLP 55 217 a 232 GKVCGSNLLSICKTAE 99 PLPm28 PLP 56 221 a 236 GSNLLSICKTAEFQMT 100 PLP 57 225 a 240 LSICKTAEFQMTFHLF 101 PLPm29 PLP 58 229 a 244 KTAEFQMTFHLFIAAF 102 PLP 59 233 a 248 FQMTFHLFIAAFVGAA 103 PLPm30 PLP 60 237 a 252 FHLFIAAFVGAAATLV 104 PLP 61 241 a 256 IAAFVGAAATLVSLLT 105 PLPm31 PLP 62 245 a 260 VGAAATLVSLLTFMIA 106 PLP 63 249 a 264 ATLVSLLTFMIAATYN 107 PLPm32 PLP 64 253 a 268 SLLTFMIAATYNFAVL 108 PLP 65 257 a 272 FMIAATYNFAVLKLMG 109 PLPm33 PLP 66 261 a 276 ATYNFAVLKLMGRGTK 110 PLP67 PLP 67 265 a 277 FAVLKLMGRGTKF 111 Tabla 3 Secuencias de MOG ID de la Mezcla ID Sec peptídica Aminoácidos Secuencia SEC ID Nº de péptidos MOG 1 1 a 16

GQFRVIGPRHPIRALV

112 MOGm1 MOG 2 a

VIGPRHPIRALVGDEV

113 MOG 3 9 a 24

RHPIRALVGDEVELPC

114 MOGm2 MOG 4 13 a 28

RALVGDEVELPCRISP

115 MOG 5 17 a 32

GDEVELPCRISPGKNA

116 MOGm3 MOG 6 21 a 36

ELPCRISPGKNATGME

117 MOG 7 a

RISPGKNATGMEVGWY

118 MOGm4 MOG 8 29 a 44

GKNATBMEVGWYRPPF 119 MOG 9 33 a 48

TGMEVGWYRPPFSRVV 120 MOGm5 MOG 10 37 a 52

VGWYRPPFSRVVHLYR 121 MOG 11 41 a 56 RPPFSRVVHLYRNGKD 122 MOGm6 MOG 12 a SRVVHLYRNGKDQDGD 123 MOG 13 49 a 64 HLYRNGKDQDGDQAPE 124 MOGm7 MOG 14 53 a 68 NGKDQDGDQAPEYRGR 125 MOG 15 57 a 72 QDGDQAPEYRGRTELL 126 MOGm8 MOG 16 61 a 76 QAPEYRGRTELLKDAI 127 MOG 17 a 80 YRGRTELLKDAIGEGK 128 MOGm9 MOG 18 69 a 84 TFLLKDAIGEGKVTLR 129 MOG 19 73 a 88 KDAIGEGKVTLRIRNV 130 MOGm10 MOG 20 77 a 92 GEGKVTLRIRNVRFSD 131 MOG 21 81 a 96 VTLRIRNVRFSDEGGF 132 MOGm11 MOG 22 85 a 100 IRNVRFSDEGGFRCFF 133 MOG 23 89 a 104 RFSDEGGFTCFFRDHS 134 MOGm12 MOG 24 93 a 108 EGGFTCFFRDHSYQEE 135 MOG 25 97 a 112 TCFFRDHSYQEEAAME 136 MOGm13 MOG 26 101 a 116 RDHSYQEEAAMELKVE 137 MOG 27 105 a 120 YQEEAAMELKVEDPFY 138 MOGm14 MOG 28 109 a 124 AAMELKVEDPFYWVSP 139 MOG 29 113 a 128 LKVEDPFYWVSPGVLV 140 MOGm15 MOG 30 117 a 132 DPFYWVSPGVLVLLAV 141 MOG 31 121 a 136 WVSPGVLVLLAVLPVL 142 MOGm16 MOG 32 125 a 140 GVLVLLAVLPVLLLQI 143 MOG 33 129 a 144 LLAVLPVLLLQITVGL 144 MOGm17 MOG 34 133 a 148 LPVLLLQITVGLVFLC 145 MOG 35 137 a 152 LLQITVGLVFLCLQYR 146 MOGm18 MOG 36 141 a 156 TVGLVFLCLQYRLRGK 147 MOG 37 145 a 160 VFLCLQYRLRGKLRAE 148 MOGm19 MOG 38 149 a 164 LQYRLRGKLRAEIENL 149 MOG 39 153 a 168 LRGKLRAEIENLHRTF 150 MOGm20 MOG 40 157 a 172 LRAEIENLHRTFDPHF 151 MOG 41 161 a 176 IENLHRTFDPHFLRVP 152 MOGm21 MOG 42 165 a 180 HRTFDPHFLRVPCWKI 153 MOG 43 169 a 184 DPHFLRVPCWKITLFV 154 MOGm22 MOG 44 173 a 188 LRVPCWKITLFVIVPV 155 MOG 45 177 a 192 CWKITLFVIVPVLGPL 156 MOGm23 MOG 46 181 a 196 TLFVIVPVLGPLVALI 157 MOG 47 185 a 200 IVPVLGPLVALIICYN 158 MOGm24 MOG 48 189 a 204 LGPLVALIICYNWLHR 159 MOG 49 193 a 208 VALIICYNWLHRRLAG 160 MOGm25 MOG 50 197 a 212 ICYNWLHRRLAGQFLE 161 MOG 51 201 a 216 WLHRRLAGQFLEELRN 162 MOGm26 MOG 52 205 a 218 RLAGQFLEELRNPF 163

Ejemplo 3 Generación de un repertorio de antígenos de mielina

Se generaron péptidos solapados que abarcaban la proteína MBP que tenían cada uno 16 aa de longitud y con 12 aa solapados. Todos los péptidos MBP se podían fabricar, sin embargo, el repertorio de péptidos MBP excluía ocho péptidos. Los 36 péptidos resultantes cubren el 95,7 % de la proteína. Solamente no se cubrieron los aminoácidos 1- 8. La lista de péptidos MBP se presenta en la Tabla 4 con los péptidos que no se utilizan resaltados en gris claro.

Tabla 4 Péptidos MBP Mezcla de Sec ID Aminoácidos péptidos MBP 1 1 a 16 MBPm1 MBP 2 a MBP 3 9 a 24 MBPm2 MBP 4 13 a 28 MBP 5 17 a 32 MBPm3 MBP 6 21 a 36 MBP 7 a MBPm4 MBP 8 29 a 44 MBP 9 33 a 48 MBPm5 MBP 10 37 a 52 MBP 11 41 a 56 MBPm6 MBP 12 a MBP 13 49 a 64 MBPm7 MBP 14 53 a 68 MBP 15 57 a 72 MBPm8 MBP 16 61 a 76 MBP 17 a 80 MBPm9 MBP 18 69 a 84 MBP 19 73 a 88 MBPm10 MBP 20 77 a 92 MBP 21 81 a 96 MBPm11 MBP 22 85 a 100 MBP 23 89 a 104 MBPm12 MBP 24 93 a 108 MBP 25 97 a 112 MBPm13 MBP 26 101 a 116 MBP 27 105 a 120 MBPm14 MBP 28 109 a 124 MBP 29 113 a 128 MBPm15 MBP 30 117 a 132 MBP 31 121 a 136 MBPm16 MBP 32 125 a 140 MBP 33 129 a 144 MBPm17 MBP 34 133 a 148 MBP 35 137 a 152 MBPm18 MBP 36 141 a 156 MBP 37 145 a 160 MBPm19 MBP 38 149 a 164 MBP 39 153 a 168 MBPm20 MBP 40 157 a 172 MBP 41 161 a 176 MBPm21 MBP 42 165 a 180 MBP 43 169 a 184 MBPm22 MBP 44 173 a 185 También se generaron péptidos solapados que abarcaban la proteína PLP que tenían cada uno 16 aa de longitud y con 12 aa solapados. No se podían fabricar todos los péptidos PLP, incluyendo las secuencias desde los aminoácidos 61-72 y 245-248. Además, el repertorio de péptidos PLP excluía 20 péptidos. Los 35 péptidos resultantes cubrían el 83,0 % de la proteína. Las únicas regiones no cubiertas fueron los aminoácidos 21-24, 61-80, 117-128, 165-168 y 237-248. La lista de péptidos PLP se muestra en la Tabla 5, con los péptidos que no se utilizaban resaltados en gris claro y los que no se fabricaron en punteado.

Tabla 5 Péptidos PLP Mezcla de Sec ID Aminoácidos péptidos PLP 1 1 a 16 PLPm1 PLP 2 a PLP 3 9 a 24 PLPm2 PLP 4 13 a 28 PLP 5 17 a 32 PLPm3 PLP 6 21 a 36 PLP 7 a PLPm4 PLP 8 29 a 44 PLP 9 33 a 48 PLPm5 PLP 10 37 a 52 PLP 11 41 a 56 PLPm6 PLP 12 a PLP 13 49 a 64 PLPm7 PLP 14 53 a 68 PLP 15 57 a 72 PLPm8 PLP 16 61 a 76 PLP 17 a 80 PLPm9 PLP 18 69 a 84 PLP 19 73 a 88 PLPm10 PLP 20 77 a 92 PLP 21 81 a 96 PLPm11 PLP 22 85 a 100 PLP 23 89 a 104 PLPm12 PLP 24 93 a 108 PLP 25 97 a 112 PLPm13 PLP 26 101 a 116 PLP 27 105 a 120 PLPm14 PLP 28 109 a 124 PLP 29 113 a 128 PLPm15 PLP 30 117 a 132 PLP 31 121 a 136 PLPm16 PLP 32 125 a 140 PLP 33 129 a 144 PLPm17 PLP 34 133 a 148 PLP 35 137 a 152 PLPm18 PLP 36 141 a 156 PLP 37 145 a 160 PLPm19 PLP 38 149 a 164 PLP 39 153 a 168 PLPm20 PLP 40 157 a 172 PLP 41 161 a 176 PLPm21 PLP 42 165 a 180 PLP 43 169 a 184 PLPm22 PLP 44 173 a 188 PLP 45 177 a 192 PLPm23 PLP 46 181 a 196 PLP 47 185 a 200 PLPm24 PLP 48 189 a 204 PLP 49 193 a 208 PLPm25 PLP 50 197 a 212 PLP 51 201 a 216 PLPm26 PLP 52 205 a 220 PLP 53 209 a 224 PLPm27 PLP 54 213 a 228 PLP 55 217 a 232 PLPm28 PLP 56 221 a 236 PLP 57 225 a 240 PLPm29 PLP 58 229 a 244 PLP 59 233 a 248 PLPm30 PLP 60 237 a 252 PLP 61 241 a 256 PLPm31 PLP 62 245 a 260 PLP 63 249 a 264 PLPm32 PLP 64 253 a 268 PLP 65 257 a 272 PLPm33 PLP 66 261 a 276 PLP67 PLP 67 265 a 277 También se generaron péptidos solapados que abarcaban la proteína MOG que tenían cada uno 16 aa de longitud y se solapaban en 12 aa. No se pudieron producir todos los péptidos MOG, incluyendo la secuencia de los aminoácidos 141-144. Además el repertorio peptídico MOG excluía ocho péptidos. Los 40 péptidos resultantes cubrían el 93,6 % de la proteína. Las únicas regiones no cubiertas eran los aminoácidos 69-80 y 141-144. La lista de péptidos MOG se muestra en la Tabla 6, con los péptidos que no se utilizaron resaltados en gris claro y los que no fue posible producir en sombreado punteado.

Tabla 6 Péptidos MOG Mezcla de Sec ID Aminoácidos péptidos MOG1 1 a 16 MOGm1 MOG2 a MOG3 9 a 24 MOGm2 MOG4 13 a 28 MOG5 17 a 32 MOGm3 MOG6 21 a 36 MOG7 a MOGm4 MOG8 29 a 44 MOG9 33 a 48 MOGm5 MOG 10 37 a 52 MOG 11 41 a 56 MOGm6 MOG 12 a MOG 13 49 a 64 MOGm7 MOG 14 53 a 68 MOG 15 57 a 72 MOGm8 MOG 16 61 a 76 MOG 17 a 80 MOGm9 MOG 18 69 a 84 MOG 19 73 a 88 MOGm10 MOG 20 77 a 92 MOG 21 81 a 96 MOGm11 MOG 22 85 a 100 MOG 23 89 a 104 MOGm12 MOG 24 93 a 108 MOG 25 97 a 112 MOGm13 MOG 26 101 a 116 MOG 27 105 a 120 MOGm14 MOG 28 109 a 124 MOG 29 113 a 128 MOGm15 MOG 30 117 a 132 MOG 31 121 a 136 MOGm16 MOG 32 125 a 140 MOG 33 129 a 144 MOGm17 MOG 34 133 a 148 MOG 35 137 a 152 MOGm18 MOG 36 141 a 156 MOG 37 145 a 160 MOGm19 MOG 38 149 a 164 MOG 39 153 a 168 MOGm20 MOG 40 157 a 172 MOG 41 161 a 176 MOGm21 MOG 42 165 a 180 MOG 43 169 a 184 MOGm22 MOG 44 173 a 188 MOG 45 177 a 192 MOGm23 MOG 46 181 a 196 MOG 47 185 a 200 MOGm24 MOG48 189 a 204 MOG 49 193 a 208 MOGm25 MOG 50 197 a 212 MOG 51 201 a 216 MOGm26 MOG 52 205 a 218 Se sintetizaron los péptidos para la longitud completa de MBP, PLP y MOG con purezas de > 95 % en la mayoría de los casos. Todos los péptidos que se podían sintetizar se evaluaron en experimentos posteriores. Un total de los 16 péptidos no se podían sintetizar por síntesis peptídica en fase sólida (SPPS). Estos 16 péptidos cubrían un intervalo único de 18 aminoácidos sobre las 3 proteínas (2,6 % del total del contenido proteico). Todos los péptidos incapaces de producirse eran hidróficos en la naturaleza. Ejemplo 4

Ensayo del análisis de epítopo Los péptidos del Ejemplo 2 se ensayaron en un ensayo de estimulación de PBMC in vivo para identificar las células T reactivas en la sangre de un paciente. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de la sangre entera, se lavaron, contaron y se colocaron en placas a 250.000 células por pocillo en un total de cuatro placas de 96 pocillos. Las mezclas de péptidos de mielina de dos 16-meros de péptido solapados se añadieron a los pocillos de PBMC por triplicado con un triplicado solo de medio en los pocillos de control incluidos en cada placa y entonces se incubaron. Tras dos días de incubación, se añadieron 20 U/ml de interleucina-2 (IL-2). El quinto día, las placas se marcaron con un radioisótopo (tiamina tritiada) y se recolectaron 6 horas después. En este ensayo, las células que incorporan la timidina tritiada son representativas de células T que se han activado y se han inducido a proliferar por los complejos receptor de célula T-péptido-MHC. Las células T incorporaban comparativamente más timidina tritiada que el control y en las células experimentales hay más células T altamente activadas y proliferan más rápidamente. Se determinaron los índices de estimulación (SI) para cada mezcla de péptidos dividiendo la media de los recuentos radiomarcados por minuto (CPM) de los pocillos estimulados por el péptido por el CPM medio de la media solo de los pocillos de control promediados entre las cuatro placas. Un SI de al menos 3 se consideraba positivo. La Figura 1 es un ejemplo de EAA de un paciente con MS. Siete de las mezclas de péptidos eran ligeramente reactivas, siendo la estimulación de los pocillos con MOGm15 muy reactiva. Las Figuras 2-4 muestran la frecuencia de reactividad a las mezclas de péptidos en 48 pacientes.

Ejemplo 5 Análisis HLA

Los péptidos activos identificados por EAA, como se describe en el Ejemplo 2, se compararon con el fenotipo HLA del paciente. Se utilizó un algoritmo para predecir las regiones de unión clase II disponible en http://www.imtech.res.in/raghava/propred/ (Singh, H. y G.P.S. Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites) para predecir las regiones de unión de MOG basadas en el haplotipo HLA-DR del paciente de DRB_0801, DRB_1501 y DRB_0101.

La Figura 5 muestra las predicciones de unión ProPred en la proteína MOG para los 3 alelos HLA del paciente. Los restos de aminoácidos en rojo representan los restos ancla previstos para la unión en la ranura HLA, mientras que los restos en amarillo representan los otros restos que se ajustan en la ranura. Como resultado, estos restos se preveían como candidatos a epítopos estimulantes para las células T de este paciente.

El cuadro amarillo brillante rodea las secuencias incluidas en la mezcla de péptido MOGm15 que daba el SI de 10. Hay secuencias en estos péptidos que se prevé que se unen a los tres alelos HLA. Para dos de los alelos hay dos epítopos de unión previstos e incluso una parte de un tercero en estas secuencias. Aunque la unión prevista de estas secuencias se correlaciona hasta cierto punto con los resultados obtenidos en el ensayo EA, hay péptidos estimulantes que no se preveían. Estos resultados muestran que el EAA proporciona resultados predictivos superiores para identificar péptidos estimulantes específicos del paciente. La superioridad de EAA aumenta en vista de las variantes de expresión HLA. Los estudios comparativos entre el tipaje serológico y molecular para los loci HLA-A y B han descubierto alelos detectados por reactivos de tipaje de ADN pero que no se detectaban por reactivos serológicos. Estas variantes de la expresión HLA no se expresan o se expresan en cantidades muy bajas en la superficie de la célula. El EAA es superior a las imágenes del software debido a que no es necesario identificar las variantes de HLA. Ejemplo 6

Producción de vacuna Los péptidos específicos del paciente que se identifican por EAA se ensayaron para determinar si se podían utilizar para producir y expandir células T reactivas a mielina para su uso en una vacuna. Se obtuvo una bolsa de sangre de 500 ml del paciente para llevar a cabo los cultivos de producción de la vacuna. Los cultivos en masa se llevaron a cabo en medio AIM V junto con los péptidos optimizados. Tras 48 horas de incubación, se añadió rIL-2 a 20 U/ml. Siete días más tarde, los cultivos se re-estimularon con PBMC y péptido. Los medios se cambiaron por uno con un 2 % de suero AB con 100 U/ml de rIL-2 en medio Vivo 15. Los cultivos se nutrieron y se dividieron cada 1-4 días si era necesario. Tras otros 7 días adicionales, los cultivos se estimularon de nuevo una vez con APC y péptidos. Los cultivos se continuaron nutriendo y dividiendo cada 1-4 días si era necesario. Tras 7-14 días adicionales, se expandieron los cultivos hasta al menos 100 x 106 células. Las células se dividieron en alícuotas de 10 x 106 células y se congelaron. Ejemplo 7

Análisis TCR VB La vacuna producida en el Ejemplo 6 se ensayó para determinar si las células T expandidas selectivamente tenían un subgrupo particular de células T. Se evaluó el enriquecimiento de los subgrupos de células T analizando la utilización de la cadena variable beta de receptor de células T (Vβ). Se evaluaron las 24 familias diferentes de región de cadena variable (Vβ) que se conocen utilizando anticuerpos monoclonales específicos marcados con fluorescencia y citometría de flujo. Si se expandía un subgrupo particular de células T por estimulación con un péptido, se debería detectar un aumento en el porcentaje de células que expresan una de las familias V beta según se expande el subgrupo.

Se llevó a cabo un análisis del receptor de células T (TCR) Vbeta tras aproximadamente 18 días en la producción de una vacuna producida como se describe en el Ejemplo 6. Se produjo una línea celular T estimulando las PBMC del paciente con la mezcla de péptidos MBPm10, que había producido un SI de 4,6 en el EAA original para este paciente. La Figura 6 muestra que la mezcla del péptido MBPm10 producía un SI de 4,6. Esta mezcla se utilizó para estimular las PBMC de este paciente en un cultivo.

La Figura 7 muestra el análisis Vbeta que se llevó a cabo en las células en la línea base, sobre las PBMC, y el Día 18 del cultivo de células T con péptidos MBPm10 de este mismo paciente. En la línea base hay la típica distribución plana de utilización de la cadena TCR Vbeta en las PBMC. Sin embargo, tras 18 días de estimulación en el cultivo con MBPm10, las células T V beta 5-6 positivas llegaban hasta el 45 % de células del cultivo, indicando que la estimulación con la mezcla del péptido MBPm10 había sido capaz de enfocar, o expandir selectivamente, un subgrupo de células T con las PBMC de este paciente. Ejemplo 8

Análisis de crecimiento Se ensayó la capacidad de estimulación con los péptidos seleccionados con EAA para expandir más rápidamente las células T estimuladas. Se analizaron las curvas de crecimiento celular para dos mezclas diferentes de péptidos estimulantes. Los datos del EAA CPM que se muestran en la Figura 8 muestran una mezcla fuertemente reactiva en MBPm19 para un paciente con un SI de 4,7. Una segunda placa del mismo ensayo mostraba otra mezcla reactiva en PLPm33 con un alto SI de 17,9. Estas dos mezclas de péptidos se utilizaron entonces para estimular PBMC de este paciente para producir líneas celulares T. Los análisis de crecimiento de los péptidos identificados por EAA se muestran en las Figura 9. Las células estimuladas con PLPm33 se expandieron desde 15 millones de PBMC a 200 millones de células T en 20 días con 3 estimulaciones con la mezcla de péptidos. Las células estimuladas con MBPm19 eran más lentas para expandirse rápidamente, pero también se expandieron de 15 millones de PBMC a 217 millones de células T después de una re- estimulación adicional con el péptido el día 21. Se recolectaron el día 27 desde el día de inicio del cultivo. Este proceso representa un proceso 6 veces más corto que los métodos de producción previos que utilizaban solo péptidos inmunodominantes de MBP, PLP y MOG. Para otro paciente de MS, se sembraron originalmente un total de 8,25 x 106 PBMC para cada condición de estimulación. A los 21 días de cultivo, después de un total de 3 estimulaciones con el péptido (sin utilizar PHA), se expandió una línea celular a 142 x 106 células, mientras que la otra línea celular se expandió a 95 x 106 células T. La Figura 10 muestra que el enfoque en TCR V beta que se produjo según progresaba el cultivo del Día 9 al Día 16 de cultivo, mientras se estimulaban con la mezcla de péptido PLPm27. El subgrupo de células T utilizando la cadena V beta 5-5 se expande a expensas de la mayoría de los otros subgrupos de células T V beta. Ejemplo 9

Control de MRTC El EAA se utilizó para evaluar la especificidad de células T reactivas a mielina (MRTC) tras la vacunación con células T. También se ensayó la detección de la diseminación del epítopo, que ocurre cuando el ataque inmunitario inicial enfocado sobre las proteínas de mielina se disemina para incluir nuevos epítopos. La Figura 11 muestra algunos de los datos de la frecuencia de MRTC de un paciente que se había sometido a la primera serie de re- tratamiento con 3 vacunas. La semana 52 después de la serie inicial de vacunas, las MRTC del paciente se habían reunido en un total de 29 MRTC por 10 millones de PBMC. El TCFA anterior, a la semana 28, había mostrado solo 4 MRTC/ 10 millones de PBMC.

Se preparó una nueva vacuna utilizando los mismos procedimientos que para la primera serie de vacunas y se reinició el tratamiento. El paciente recibió un refuerzo la semana 4 y la semana 8 y el número de MRTC cayó a 6/10 millones de PBMC. Quince semanas más tarde, a la semana 24, las MRTC del paciente habían empezado a reaparecer, particularmente las células T reactivas a MBP.

La Figura 12 muestra la reactividad de las células T del paciente la semana 24 a los péptidos MBP de longitud completa. Los cuadros rodean los péptidos que contienen dos secuencias MBP inmunodominantes que se utilizaron previamente en el TCFA. Como se puede ver, hay aún reactividad al péptido MBP 2, que puede tenerse en cuenta para el aumento de la reactividad contra MBP que se ve también en el TCFA.

Las Figuras 13 y 14 muestran la reactividad de células T del paciente la semana 24 a los péptidos que abarcan la longitud completa de las proteínas PLP y MOG, respectivamente. Los cuadros rodean los péptidos que contienen las dos secuencias inmunodominantes de PLP y MOG que se utilizaron previamente y en el TCFA. Como se indica, hay tres áreas en PLP y dos áreas en MOG que muestran una reactividad más fuerte en el EAA. Este análisis se ha utilizado para producir una nueva vacuna para el paciente utilizando las seis mezclas de péptidos reactivos identificados nuevamente. Ejemplo 10

Sumario del análisis EAA 1 Las Figuras 15-17 muestran el patrón de reactividad a los péptidos MBP, PLP y MOG, respectivamente en 8 pacientes con MS. La línea roja muestra el corte positivo SI de 3. Los dos péptidos inmunodominantes de MBP, PLP y MOG que se habían utilizado anteriormente se identifican por los cuadros. Como se indica en la Figura 15, hay un epítopo en MBPm18 que no está presente en los dos péptidos MBP inmunodominantes. Para PLP, la Figura 16 indica que hay otras tres áreas de inmunorreactividad no incluidas en los péptidos PLP inmunodominantes. La inmunorreactividad más alta estaba en las 3 regiones al final de la secuencia de la proteína PLP. Para MOG, la Figura 17 indica que la parte transmembrana y la inmediatamente intracelular de la proteína es mucho más inmunorreactiva que los péptidos MOG inmunodominantes utilizados anteriormente.

Las Figuras 18-20 muestran los SI medios de las muestras de un total de 15 pacientes con MS ensayados durante el ensayo EA. Como se puede ver, se apreciaba un ligero aumento de la reactividad hacia el extremo C de MBP. Cuando se analizan los mismos datos para la proteína PLP, el área inmunodominante, de nuevo en el extremo C de esta proteína, es muy evidente. El análisis de la reactividad contra la proteína MOG muestra el área inmunodominante en la región transmembrana así como en la región del extremo C de la proteína. En conjunto, los datos indican que es importante incluir otros epítopos peptídicos de las proteínas de mielina para identificar las células T reactivas a mielina a partir de pacientes con MS para su uso en vacunas de células T con el fin de producir una vacuna más eficaz de una forma más eficiente.

El conocimiento del patrón de la diseminación o cambio del epítopo, en la MS se puede utilizar para diseñar terapias de vacunación con células T específicas de péptido que bloqueen el curso de la destrucción tisular. Los EAA secuenciales se pueden utilizar para determinar si, y cuando, un paciente desarrolla reactividad contra “nuevos” epítopos en las 3 proteínas de mielina analizadas. Los péptidos reactivos identificados nuevamente se pueden utilizar para producir líneas de células T para una vacuna de seguimiento.

Ejemplo 11 Sumario del análisis EAA 2

Se llevó a cabo el EAA en 54 sujetos. Los sujetos incluían individuos sanos (N=12), pacientes con MS inscritos en un ensayo clínico de escalado de dosis para Tovaxin (N=16), pacientes con MS inscritos en un ensayo clínico de vacunación repetida (Estudio de Extensión) para Tovaxin (N=13), y pacientes con MS inscritos en un ensayo clínico de extracción de sangre solo (Método de desarrollo) (N=13). La Tabla 4 muestra la reactividad de los sujetos a las mezclas de péptidos de mielina. Las Tablas 5-7 muestran la reactividad de los sujetos a las mezclas de péptidos MBP, PLP y MOG, respectivamente. Las Figuras 21-23 muestran la reactividad de los sujetos a las mezclas de péptidos de mielina con los cuadros que indican la localización de los péptidos inmunodominantes utilizados en la producción de la vacuna del Ejemplo 1.

Tabla 7 Reactividad de péptidos de mielina Grupo de sujetos: nº de reactivos/N Porcentaje de Reactivos Sanos 7/12 58 Método de desarrollo1 9/13 69 Escalado de dosis Vacunados2: 8/9 89 Intactos: 5/73 71 Estudio de Extensión Vacunados2: 9/9 100 Intactos4: 4/4 100 Los 13 sujetos ensayados tomaron una terapia para MS inmunomodulante aprobada. 2 Vacunados con Tovaxin preparado utilizando solo 6 péptidos. 3 Las dos muestras que eran negativas se realizaron con células congeladas. 4 Intacto a Tovaxin; estos pacientes se habían vacunado previamente con una vacuna preparada con péptidos solo de MBP.

Tabla 8 Reactividad a péptidos MBP nº de Porcentaje de Grupo de sujetos: reactivos/N Reactivos Sanos 3/12 Método de desarrollo 3/13 23 Escalado de dosis Vacunados: 2/9 22 Intactos: 2/7 29 Estudio de Extensión Vacunados: 5/9 56 Intactos: 1/4 Tabla 9 Reactividad a péptidos PLP Grupo de sujetos: nº de reactivos/N Porcentaje de Reactivos Sanos 5/12 42 Método de desarrollo 6/13 46 Escalado de dosis Vacunados: 7/9 78 Intactos: 4/7 57 Estudio de Extensión Vacunados: 8/9 89 Intactos: 3/4 75 Tabla 10 Reactividad a péptidos MOG Grupo de sujetos: nº de reactivos/N Porcentaje de Reactivos Sanos 6/12 Método de desarrollo 7/13 54 Escalado de dosis Vacunados: 4/9 44 Intactos: 3/7 43 Estudio de Extensión Vacunados: 9/9 100 Intactos: 3/4 75 La reactividad a al menos una mezcla peptídica de mielina se apreció en 42 de los 54 sujetos ensayados (78 %), que incluyen 7 de los 12 sujetos sanos. El número de mezclas peptídicas a los que reaccionaron los sujetos variaban de 0 a 11. La reactividad positiva variaba desde el SI mínimo de 3,0 al SI máximo de 21,1. Como se muestra en los patrones de reactividad, la mayoría de los sujetos ensayados tenían células T reactivas a las secuencias de péptidos en las áreas de las tres proteínas de mielina aparte de los seis péptidos inmunodominantes que se utilizaron para preparar las vacunas del Ejemplo 1. El cuarenta y uno por ciento de los sujetos ensayados eran reactivos a los péptidos inmunodominantes de MBP (MBP 83-99 y MBP 151-170). Solamente el 31 % de los sujetos ensayados eran reactivos a los péptidos inmunodominantes PLP (PLP 30-49 y PLP 180-199). Solo el 11 % de los sujetos ensayados eran reactivos a las secuencias peptídicas inmunodominantes de MOG (MOG 1-17 y MOG 19-39). El patrón de reactividad aparece inicialmente consistente con los estudios previos que identifican la secuencia peptídica MBP 83-99 como más reactiva que los péptidos PLP y MOG. Sin embargo, en general, la reactividad contra los péptidos MBP era menor que la reactividad que se aprecia contra los péptidos PLP y MOG; el 30 % de todos los sujetos ensayados eran reactivos contra uno o más péptidos MBP en oposición al 65 % para péptidos PLP y el 61 % para los péptidos MOG. La Tabla 11 a continuación muestra el número medio de péptidos para cada proteína contra los que los sujetos eran reactivos.

Tabla 11 Media del nº de péptidos contra los que los sujetos son reactivos: MD (n=13) H.S. (n=12 DES (n=16) EXT (n=13) MBP 0,5 0,3 0,4 0,5 PLP 0,8 0,8 2,0 2,2 MOG 1,0 1,0 1,3 1,8 TOTALES: 2,3 2,1 3,6 4,6 MD= Sujetos del Método de Desarrollo de extracción de sangre H.S.= Sujetos Sanos DES= Pacientes de Escalado de dosis (tanto vacunados como intactos) EXT= Pacientes del Estudio de Extensión En el caso de la proteína MOG, los estudios previos se enfocaron en la parte extracelular de la proteína. MOG tiene una parte extracelular que incluye los aa 1-122 con un dominio tipo Ig, una parte transmembrana y una parte intracelular que comprende los aa 123-218. Los resultados anteriores indican un alto nivel de reactividad para la parte de la proteína que está en o pasa inmediatamente la secuencia transmembrana en el espacio intracelular, aminoácidos 113-132 (MOGm15). De manera interesante, todos los pacientes del estudio de Extensión (el 100 %), que se habían vacunado previamente con la vacuna del Ejemplo 1, mostraban inmunorreactividad con la parte intracelular de MOG. Esto es lo contrario a todos los demás sujetos ensayados, de los que solo el 49 % mostraban alguna reactividad a los péptidos MOG.

Cultivo de líneas celulares T reactivas a la mielina con índices de estimulación bajos A continuación se demuestra la capacidad de células T reactivas a la mielina para crecer con un SI de menos de 3,0 y especialmente por debajo de 2,0. Utilizando los algoritmos que se describen anteriormente, se han observado SI estadísticamente significativos tan bajos como de 1,3 y por lo tanto deberían ser capaces de crecer en respuesta al antígeno. Para verificar esta capacidad, se presentan 5 líneas celulares por medio de dos pacientes con un SI < 2,0. Los resultados se muestran en la Tabla 12 y la Figura 4, que indican el crecimiento de estas líneas celulares solo con la estimulación del antígeno peptídico y factores de crecimiento de células T comunes.

Las PBMC para el sujeto 1042 se procesaron en el EAA, y 2 mezclas peptídicas eran positivas, que incluían PLPm18 con un SI de 1,8, PLPm26 con un SI de 2,5 y PLPm28 con un SI de 2,5. Las células se sometieron a estimulación antigénica con en el protocolo normal como se muestra posteriormente y se recolectaron a los 14, 19, 26, 33 y 35 días después. Las PBMC del sujeto 1014 se procesaron en el EAA, y 4 mezclas eran positivas, incluyendo MBPm14 con un SI de 1,7, PLPm17 con un SI de 1,7, PLPm28 con SI de 2,2 y MOGm6 con un SI de 1,9.

Las células del sujeto 1014 se sometieron a estimulación antigénica como se muestra posteriormente y se recolectaron a los 14, 19, 26, 33 y 35 días después. Las PBMC se aislaron por medio de centrifugación en gradiente de densidad a partir de la sangre periférica obtenida por medio de venopunción en anticoagulante ACD-1. Las PBMC se colocaron en placas a 2,5E+06 células/pocillo en placas de 24 pocillos. Se añadió el antígeno en forma de péptidos 16-meros que se identificaron en el EAA a una concentración final de 20 ug/ml. Se añadió interleucina-2 (IL-2) a una concentración final de 100 U/ml comenzando a las 48 horas y se añadió IL-2 a la misma concentración en cada alimentación o división de los pocillos. La re- estimulación con el péptido en presencia de células presentadoras de antígeno (PBMC con APC autólogas radiadas con 3500 rad) se hizo los días 7, 14 y 21. Se añadió interleucina-15 (IL-15) a una concentración final de 5 ng/ml-20 ng/ml (específico del lote) comenzando el día 14 y continuando durante el resto del periodo de cultivo. Las líneas celulares se recolectaron todas en el día 35 y habían conseguido expansiones de 3,0-8,2 veces.

La Figura 24 muestra que las 5 líneas celulares T de los sujetos 1042 y 1014 reactivas a las mezclas peptídicas de mielina con SI < 2,0 eran capaces de crecer en respuesta al antígeno. Por lo tanto, las líneas celulares T que presentan bajos SI pueden cultivarse en respuesta al antígeno de mielina.

Ejemplo 12 Análisis EAA de péptidos reactivos a la mielina Los péptidos del Ejemplo 3 se ensayaron en 429 EAA en ensayos clínicos de la siguiente manera. Un total de 162 de los 429 ensayos (37,8 %) mostraban SI positivos utilizando el Método de Evaluación de la Varianza o el Método de la Varianza CPM. Los EAA prevacunales tenían 158 positivos de 387 ensayos (40,8 %), con pacientes de MS remitiendo de recaída (RRMS) que mostraban 150 positivos de 368 ensayos (40,8 %), y pacientes con Síndrome Aislado Clínicamente (CIS) que mostraban 8 positivos de 19 ensayos (42,1 %).

De los sujetos explorados, 144 ensayos de 312 en total eran positivos de 249 sujetos (46,2 % y 57,8 % respectivamente). De estos, los pacientes RRMS mostraban 136 positivos de 301 ensayos en 238 sujetos (45,2 % y 57,1 %, respectivamente), y los pacientes CIS mostraban 8 positivos de 11 ensayos (72.7 %). Durante la obtención 14 de 89 ensayos (15,7 %) eran positivos, de los cuales los pacientes RRMS habían mostrado 14 positivos de 84 ensayos (16,7 %), y los pacientes CIS mostraban 0 positivos de 5 ensayos (0 %). Durante los EAA de la línea base, 6 de 31 ensayos (19,4 %) eran positivos, mostrando los pacientes RRMS 6 positivos de 28 ensayos (21,4 %), los pacientes CIS mostraban 0 positivos de 3 ensayos (0 %). Los EAA postvacunales mostraron 4 de 42 ensayos (9,5 %) positivos, de los cuales los pacientes RRMS mostraron 3 positivos de 37 ensayos (8,1 %), y los pacientes CIS mostraban 1 positivo de 5 ensayos (20,0 %). Los EAA de la semana 4 mostraban 2 positivos de 21 ensayos (9,5 %), de los que los pacientes RRMS mostraban un positivo de 19 ensayos (5,3 %), y los pacientes CIS mostraban 1 positivo de 2 ensayos (50,0 %). Los EAA de la semana 8 mostraban 2 positivos de 16 ensayos (12,5 %), de los cuales los pacientes RRMS mostraban 2 positivos de 14 ensayos (14,3 %) y los pacientes CIS mostraban 0 positivos de 2 ensayos (0 %). Los EAA de la semana 12 mostraban 0 positivos de 5 ensayos (0 %), de los cuales los pacientes RRMS mostraban 0 positivos de 4 ensayos (0 %) y los CIS mostraban 0 positivos de 1 ensayo (1 %). Ejemplo 13

Ensayo clínico EAA Durante el curso de 6 meses, se llevó a cabo un estudio con 120 sujetos que cumplían los criterios para el ensayo clínico. Los sujetos tenían Esclerosis Múltiple remitiendo de recaída (RR-MS; n = 114) o Síndrome Aislado Clínicamente de alto riesgo (CIS; n = 6) con una Escala de Estado de Discapacidad Expandida (EDSS) de 0-5,5, diagnóstico de la enfermedad de 0-10 años, 18-55 años de edad, criterios MRI sugerentes de MS y un EAA positivo. La población de sujetos mencionada anteriormente se evaluó por EAA utilizando el Método de Evaluación de Varianza y Método de Varianza CPM como se ha descrito anteriormente, y se consideraban candidatos para la producción de vacunas. De los 120 intentos para fabricar la vacuna, hubo 2 fallos de transporte (la sangre no se recibió según los criterios establecidos), se perdió 1 cultivo por contaminación y 5 muestras llegaron con un bajo volumen celular/rendimiento. De los 112 sujetos restantes, se generó satisfactoriamente la vacuna en 89 sujetos, con 22 aún en producción (el 98,9 % de muestras candidatas, el 92,5 % de todas las muestras completadas). A partir de esto, un EAA positivo se consideraba predictivo de la capacidad para producir una vacuna a una dosis terapéutica por los métodos desvelados en el presente documento. Los métodos actuales para cultivar las líneas celulares T incluyen: 1. Aislamiento de PBMC 2. Colocación en placas de las PBMC en placas de 24 pocillos a 2,5E+06 células/pocillo 3. Añadir el antígeno a 20 ug/ml/péptidos, 2 péptidos/pocillo 4. Adición de IL-2 (10-200 UI/ml) a las 48 horas (e incluida hasta la recolección) 5. Re-estimulaciones con APC radiadas a 3500 rad (1,0E+06 como se ha descrito anteriormente) y antígeno (el mismo antígeno/misma concentración) los días 7, 14 y 21 6. Adición de IL-15 (1-50 ng/ml) el día 14 (e incluida hasta la recolección) 7. Potencial para la adición de mitógeno, superantígeno o anticuerpo para estimular el crecimiento el d35 si las células no habían crecido una cantidad suficiente Durante el curso de este estudio se descubrieron varios epítopos con inmunodominancia en esta población de sujetos con MS. Varios de estos epítopos eran nuevos. Estos eran péptidos que mostraban reactividad en un gran número de sujetos explorados en el ensayo. Varias de estas regiones inmunodominantes no se habían descrito anteriormente en la bibliografía. Los epítopos de interés se enumeran en las Tablas 13-15.

Tabla 13 Listado por frecuencia de identificación

Mezcla

nº de Sujetos % de Sujetos

peptídica

MOGm21

40

33,6 %

PLPm26

28

23,5 %

MOGm15

27

22,7 %

PLPm4

26

21,8 %

MOGm23

20

16,8 %

MOGm24

15

12,6 %

PLPm17

14

11,8 %

PLPm32

12

10,1 %

PLPm19

11

9,2 %

PLPm33

11

9,2 %

PLPm18

10

8,4 %

MOGm26 9 7,6 % MBPm8 8 6,7 % MOGm5 8 6,7 % MBPm9 7 5,9 % PLPm24 7 5,9 % MBPm13 6 5,0 % MOGm19 6 5,0 % MOGm2 6 5,0 % PLPm27 6 5,0 % PLPm28 6 5,0 % MBPm14 4,2 % MBPm20 4,2 % MBPm3 4,2 % MOGm11 4,2 % MOGm7 4,2 % PLP67 4,2 % MBPm16 4 3,4 % MBPm17 4 3,4 % MBPm22 4 3,4 % MOGm12 4 3,4 % MOGm16 4 3,4 % MOGm3 4 3,4 % MOGm6 4 3,4 % PLPm1 4 3,4 % PLPm11 4 3,4 % PLPm6 4 3,4 % MBPm15 3 2,5 % MBPm19 3 2,5 % MBPm2 3 2,5 % MBPm4 3 2,5 % MBPm7 3 2,5 % MOGm1 3 2,5 % MOGm4 3 2,5 % PLPm13 3 2,5 % PLPm25 3 2,5 % MBPm10 2 1,7 % MBPm12 2 1,7 % MOGm14 2 1,7 % MOGm22 2 1,7 % PLPm22 2 1,7 % MBPm21 1 0,8 % MBPm6 1 0,8 % MOGm20 1 0,8 % PLPm12 1 0,8 % Tabla 14 Mezclas peptídicas positivas en > 8 % de esta población

Mezcla

Extremo

Extremo

Secuencias de

peptídica

N

C

aminoácidos

PLPm4 a 44 véase el Ejemplo 2 PLPm17 129 a 148 PLPm18 137 a 156 PLPm19 145 a 160 PLPm26 201 a 220 PLPm32 249 a 268 PLPm33 257 a 276 MOGm15 113 a 132 MOGm21 161 a 180 MOGm23 177 a 196 MOGm24 185 a 204 Tabla 15 Listado como secuencias inmunodominantes

Secuencias de

Proteína Tramo del péptido

aminoácidos

PLP a 44 véase el Ejemplo 2 PLP 129 a 160 PLP 201 a 220 PLP 249 a 276 *MOG 113 a 132 MOG 161 a 204 Las Figuras 25-27 muestran los resultados de este ensayo clínico. Las Figuras 25A-H muestran un mapa de los 429 ensayos (los ensayos únicos de arriba a abajo y los péptidos de izquierda a derecha). Los ensayos se alinean por fecha. Las mezclas peptídicas positivas se muestran en gris. Esto muestra que las mezclas peptídicas que eran positivas eran únicas e impredecibles. La Figura 26 muestra un mapa de 65 ensayos (los ensayos únicos de arriba a abajo y los péptidos de izquierda a derecha). Los ensayos se alinearon por fecha. Las mezclas peptídicas positivas se muestran en gris. Esto muestra que las mezclas peptídicas que eran positivas eran únicas e impredecibles. El número de mezclas positivas variaba en un único sujeto desde 0 a 19. La Figura 27 muestra los resultados el análisis EAA que indica un cambio de epítopo en 4 sujetos. El sujeto 1 mostraba un pequeño cambio con reactividad primero englobando MOGm4, MOGm5 y MOGm6 y moviéndose a MOGm21, MOGm22 y MOGm23. Nótese que estos dos se solapan. El sujeto 2 mostraba los mismos péptidos reactivos con el tiempo, pero con una reactividad creciente a nuevos péptidos adicionales desde el momento cero. El sujeto 3 mostraba un cambio significativo en la reactividad desde PLP a MOG y el sujeto 4 mostraba múltiples epicentros de reactividad con un cambio gradual desde un área (extremo C de PLP) a otro (extremo N de MOG). También en este mismo sujeto se observó una reactividad a largo plazo pero transitoria hacia la porción central de MOG y finalmente una reactividad a MBP en los últimos dos puntos de tiempo. LISTADO DE SECUENCIAS <110> OPEXA THERAPEUTICS Williams, Jim C. Montgomery, Mitzi Newsom, Brian <120> VACUNA DE CÉLULAS T <130> 050989.0204.02pc00 <150> US 60/746.611 <151> 05-05-2006 <150> US 60/747.903 <151> 22-05-2006 <160> 163 <170> PatentIn versión 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 8 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 9 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 14 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 18 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 19 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 23 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 24 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 27 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 28 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 32 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 33 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 34 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 38 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 42 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 43 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 45 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 46 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 50 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 51 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 54 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 55 <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 58 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 59 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 63 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 66 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 67 <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 70 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 71 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 75 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 76 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 79 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 80 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 83 <210> 84 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 84 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 <210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 88 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 92 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 93 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 <210> 95 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 <210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 97 <210> 98 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 98 <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 101 <210> 102 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 102 <210> 103 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 <210> 104 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 <210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 106 <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 107 <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 110 <210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 111 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 <210> 114 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 114 <210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 115 <210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 <210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 <210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 119 <210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 <210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 123 <210> 124 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 124 <210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 <210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 126 <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 127 <210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 <210> 129 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 131 <210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 132 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 <210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 135 <210> 136 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 136 <210> 137 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 <210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 <210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 <210> 140 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 <210> 141 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 141 <210> 142 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 142 <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 <210> 144 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 <210> 145 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 145 <210> 146 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 146 <210> 147 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 <210> 148 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 <210> 149 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 <210> 150 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 150 <210> 151 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 <210> 152 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 <210> 153 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 153 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 154 <210> 155 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 <210> 156 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 <210> 157 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 <210> 158 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 <210> 159 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 <210> 160 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 160 <210> 161 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 161 <210> 162 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una vacuna de células T, que comprende: (a) proporcionar una muestra que comprende células T aisladas de un paciente; (b) añadir mezclas peptídicas que comprenden cada una diferentes péptidos a una pluralidad de porciones de la muestra, en donde cada péptido diferente en la mezcla peptídica es de 8-20 aminoácidos y comprende una secuencia solapante de 4-19 aminoácidos con otro péptido diferente de la mezcla peptídica; y en donde las secuencias de diferentes péptidos en las mezclas peptídicas comprenden colectivamente la secuencia completa de un antígeno polipeptídico; e (c) identificar una parte de la muestra que comprende células T autorreactivas activadas, en donde una mezcla peptídica que activa las células autorreactivas identificadas por (c) con un índice de estimulación por encima de un valor predeterminado es una mezcla peptídica específica de un paciente; (d) proporcionar una muestra adicional que comprende células T aisladas del paciente; (e) poner en contacto las células T con las mezclas peptídicas específicas del paciente identificadas en las etapas (a) a (c), por lo que las células T autorreactivas se activan; (f) expandir las células T autorreactivas activadas; y (g) atenuar las células T autorreactivas, de forma que las células T sean incompetentes para la replicación pero aún viables; en donde el índice de estimulación para cada mezcla peptídica se calcula comparando la incorporación de [3H] timidina en una muestra de células T del paciente cultivadas en presencia de una mezcla peptídica que comprende una parte del polipéptido, con la incorporación de [3H] timidina en una muestra de células T cultivadas solo en un medio de control, que se expresa como el cociente de los recuentos medios por minuto de alícuotas de antígeno/recuentos medios por minuto de las alícuotas de control, en donde el valor predeterminado es de al menos 1,3. 2. El método de la reivindicación 1 en el que el antígeno polipeptídico es MBP, PLP, MOG o una combinación de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1 en el que los diferentes péptidos tienen 12-16 aminoácidos y comprenden secuencias que se solapan 8-12 aminoácidos.