Sustratos fluorescentes sacarídicos, su procedimiento de preparación y sus utilizaciones.

Sustrato enzimático fluorescente caracterizado por el hecho de que corresponde a la siguiente estructura

(I):

S-B(l)n-F (I)

en la que:

- S es un esqueleto de naturaleza sacarídica constituido, como mínimo, por una unidad sacarídica, y escogido entre los monosacáridos, los oligosacáridos, que tienen de 2 a 9 unidades sacarídicas, y los polisacáridos que tienen, como mínimo, 10 unidades sacarídicas

- F es un grupo fluoróforo soportado por el brazo separador B;

- I es un grupo inhibidor de la fluorescencia de F; siendo dicho grupo I un sustituyente lateral de, como mínimo, una subunidad del brazo separador B;

debiéndose entender que ningún enlace covalente conecta directamente el grupo fluoróforo al grupo inhibidor;

- n es un número entero igual a 1 ó 2;

- B representa un grupo separador autodivisible constituido por una o varias subunidades; encontrándose dicho brazo B fijado en posición anomérica de dicha unidad sacarídica S, encontrándose el enlace anomérico indiferentemente en posición a o b, correspondiéndose dicho brazo B a un lugar reconocido y fraccionado por una enzima y que comprende una subunidad B1 escogida entre:

i) los grupos aromáticos monocíclicos de fórmula (II) siguiente:

en la que:

- Fonc es una función química reactiva con respecto a una función química complementaria de un grupo fluoróforo F o bien de un grupo inhibidor de la fluorescencia de un grupo fluoróforo F,

- la flecha que sale del átomo de oxígeno directamente soportada por el ciclo fenilo representa el punto de acoplamiento de dicha subunidad B1 con una unidad sacarídica del brazo separador, con intermedio de un enlace covalente con el átomo de carbono situado en posición 1 anomérica de dicha unidad sacarídica,

- la flecha que sale del átomo de oxígeno enlazada al radical -CH2- representa el punto de acoplamiento de dicha subunidad B1 con una subunidad B2, escogida entre los grupos aromáticos de fórmula (III) siguiente.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08290835.

Solicitante: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: BATIMENT "LE PONANT D" 25, RUE LEBLANC 75015 PARIS FRANCIA.

Inventor/es: TEXIER-NOGUES,ISABELLE, DURRAT,FRANÇOIS, ROBERT,VÉRONIQUE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K49/00 (Preparaciones para examen in vivo )
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/542 (con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/52 (Utilización de compuestos o de composiciones para investigaciones colorimétricas, espectrofotométricas o fluorométricas, p. ej. utilización de cintas de papel indicador)

PDF original: ES-2476601_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Sustratos fluorescentes sacarïdicos, su procedimiento de preparaciïn y sus utilizaciones La presente invenciïn se refiere a sustratos enzimïticos fluorescentes de naturaleza sacarïdica que presentan un brazo separador autodivisble, funcionalizado por un fluorïforo F y, como mïnimo, por un inhibidor de la fluorescencia de F, haciendo referencia tambiïn a su utilizaciïn para la preparaciïn de un reactivo de diagnïstico para la formaciïn de imïgenes funcionales in vivo, asï como al reactivo de diagnïstico para la formaciïn de imïgenes funcionales que comprende, como mïnimo, dicho sustrato enzimïtico.

La fluorescencia es una tïcnica muy utilizada para la detecciïn de actividades enzimïticas in vitro. Es una tïcnica poco costosa, rïpida y, en general, muy sensible. Numerosas enzimas de importancia biolïgica significativa tienen por sustratos derivados sacarïdicos que pueden ser utilizados, en especial, para efectuar dosificaciones enzimïticas sobre muestras biolïgicas (sangre, orina, etc, ) sobre cïlulas (fijadas o en cultivo) o, asimismo, sobre tejidos (tejidos de animales sacrificados, biopsias) .

Son aplicaciones que parecen igualmente prometedoras las aplicaciones in vivo, en especial, para la formaciïn de imïgenes de fluorescencia de animales pequeïos. En efecto, genes informadores que expresan diferentes enzimas tales como β-galactosidasa (β-gal) , β-glucuronidasa (β-glu) , cloramfenicol, acetiltransferasa, luciferasa, proteïnas fluorescentes tales como “Green Fluorescent Protein” (GFP) , son muy utilizadas en la actualidad en biologïa para estudiar la expresiïn de genes (transcripciïn y traducciïn de ADN en proteïnas) , la transfecciïn, u otros procesos biolïgicos. Los genes informadores pueden servir de testigos para demostrar la introducciïn y la transcripciïn de otro gen de interïs situado en la misma parte codificante del ADN. Las construcciones de ADN que contienen los genes informadores son introducidas en el animal para formar animales transgïnicos. Por ejemplo, el nïmero de ratones transgïnicos ya construidos es muy importante y aumenta con rapidez. En un nïmero muy grande de casos, el gen marcador utilizado es el gen lacZ que codifica para la β-gal de E. coli. Otro ejemplo de gen marcador igualmente utilizado es el gen gusA que codifica para la β-glu de E. coli. No obstante, los sustratos de las enzimas expresadas por algunos de estos genes y, en particular, por los genes lacZ y gusA son derivados sacarïdicos. Es, por lo tanto, muy importante poder disponer de sustratos sacarïdicos para poder detectar la actividad de estas enzimas.

Numerosos sustratos de naturaleza sacarïdica existen ya para detectar actividades enzimïticas, tales como, por ejemplo, las actividades enzimïticas de β-gal y β-glu. Estos sustratos enzimïticos pueden ser especialmente:

- sustratos para la formaciïn de imïgenes de tipo nuclear,

- sustratos quimioluminiscentes tales como los sustratos comercializados con las denominaciones comerciales Lumi-Gal ï 530 por la sociedad Lumigen Inc. (USA) y Galacton-Star ï por la sociedad Applied-Biosystems (USA) ;

-sustratos para la detecciïn dielectroforïtica, -sustratos para IRM,

- sustratos que forman precipitados,

- sustratos para dosificaciones espectrofotomïtricas, entre ellos el sustrato X-gal (5-bromo-4-cloro-3-idolil-betaD-galactopiranosa) vendido, por ejemplo, con la denominaciïn comercial Blue Tech ï por la sociedad Mirador DNA Design Inc; y

- sustratos fluorescentes.

De modo ideal, estos sustratos deben tener las propiedades siguientes:

- una cinïtica de reacciïn enzimïtica rïpida,

- una dïbil constante de Michaelis,

- una diferencia grande de las propiedades de interïs del sustrato y las de su producto o productos (propiedades de interïs: absorciïn para un sustrato cromogïnico, fluorescencia para un sustrato fluorogïnico, etc…) .

El interïs de los sustratos fluorescentes, con respecto a otros sustratos que se han descrito anteriormente, es su sensibilidad de detecciïn y el reducido coste de instrumentaciïn necesario para utilizarlos. Permiten, de igual manera que el IRM y, en ciertas condiciones, realizar una detecciïn enzimïtica in vivo.

De manera general, los sustratos enzimïticos fluorescentes funcionan segïn el principio siguiente: un sustrato no fluorescente en la gama de longitud de onda de detecciïn facilita un producto fluorescente en esta misma gama de longitud de onda cuando es puesto en presencia de una enzima de la que se desea detectar la actividad, y que es especïfica del sustrato utilizado. Por lo tanto, es necesario encontrar fluorïforos cuya fluorescencia es inhibida inicialmente cuando son injertados en el sustrato, y que sean capaces de liberarse despuïs de reacciïn con la enzima de la que se desea detectar la actividad. La elecciïn de los fluorïforos disponibles comercialmente se encuentra, por lo tanto, limitada por esta condiciïn de inhibiciïn inicial de la fluorescencia cuando el fluorïforo estï fijado sobre el sustrato enzimïtico.

In vivo, el desarrollo reciente de mïtodos ïpticos abre nuevos horizontes para la formaciïn funcional de imïgenes. Actualmente, es posible seguir, en tiempo real y de forma no invasiva la expresiïn de los genes en animales, en particular, ratones, despuïs de anestesia. La formaciïn de imïgenes ïpticas presenta un cierto nïmero de ventajas con respecto a otras tïcnicas de formaciïn de imïgenes funcionales, tales como formaciïn de imïgenes por resonancia magnïtica (IRM) , imïgenes por tomografïa de emisiïn de posiciones (TEP) y formaciïn de imïgenes por emisiïn monofotïnica (SPECT) :

- evita la manipulaciïn de molïculas radiactivas, evitando de esta manera las limitaciones y riesgos

relacionados con las mismas (radio-protecciïn, gestiïn de desperdicios, fuente de sincrotrïn para los marcadores TEP) ;

- no requiere una gran inversiïn en instrumentaciïn;

- presenta una buena sensibilidad con respecto a IRM en tïrminos de cantidad de marcador inyectado.

La formaciïn de imïgenes ïpticas utiliza sustratos enzimïticos fluorescentes.

Cuando se desea detectar la presencia de una actividad enzimïtica in vivo, por ejemplo, en un animal de laboratorio de pequeïas dimensiones, tales como ratones, pocas molïculas fluorescentes se encuentran a disposiciïn para esta aplicaciïn. En efecto, para que la luz de excitaciïn y la luz emitida por el fluorïforo puedan atravesar los tejidos, 20 es necesario utilizar fluorïforos que absorban y emitan en los infrarrojos prïximos, es decir, en una longitud de onda comprendida entre 640 y 900 nm. No obstante, se encuentran muy pocas molïculas fluorescentes en este dominio de longitudes de onda actualmente disponibles comercialmente (limitaciïn esencialmente a cianinas) . La doble limitaciïn, es decir, inhibiciïn inicial de la fluorescencia cuando el fluorïforo estï fijado sobre el sustrato, y utilizaciïn de un fluorïforo que absorbe y emite en los infrarrojos prïximos se encuentra, sin duda, en el origen de la ausencia de sustrato enzimïtico fluorescente de naturaleza sacarïdica en este dominio de longitudes de onda.

En efecto, la mayor parte de los sustratos enzimïticos fluorescentes de naturaleza sacarïdica actualmente disponibles en el mercado no estï construida a partir de agrupaciones de fluorïforos absorbentes y ni emiten en los infrarrojos prïximos. Por ejemplo, resulta posible conseguir:

- sustratos a base de fluoresceïna para la detecciïn de la actividad β-gal, entre los que se pueden mencionar, por ejemplo, el FDG (fluorescein-di-β-D-galactopiranosa) (excitaciïn 490 nm / emisiïn 514 nm) o uno de sus... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Sustrato enzimïtico fluorescente caracterizado por el hecho de que corresponde a la siguiente estructura (I) :

S-B (l) n-F (I)

en la que:

- S es un esqueleto de naturaleza sacarïdica constituido, como mïnimo, por una unidad sacarïdica, y

escogido entre los monosacïridos, los oligosacïridos, que tienen de 2 a 9 unidades sacarïdicas, y los polisacïridos que tienen, como mïnimo, 10 unidades sacarïdicas

- F es un grupo fluorïforo soportado por el brazo separador B;

- I es un grupo inhibidor de la fluorescencia de F; siendo dicho grupo I un sustituyente lateral de, como

mïnimo, una subunidad del brazo separador B; 15 debiïndose entender que ningïn enlace covalente conecta directamente el grupo fluorïforo al grupo inhibidor;

- n es un nïmero entero igual a 1 ï 2;

- B representa un grupo separador autodivisible constituido por una o varias subunidades; encontrïndose dicho brazo B fijado en posiciïn anomïrica de dicha unidad sacarïdica S, encontrïndose el enlace anomïrico indiferentemente en posiciïn α o β, correspondiïndose dicho brazo B a un lugar reconocido y

fraccionado por una enzima y que comprende una subunidad B1 escogida entre: i) los grupos aromïticos monocïclicos de fïrmula (II) siguiente:

en la que:

- Fonc es una funciïn quïmica reactiva con respecto a una funciïn quïmica complementaria de un grupo fluorïforo F o bien de un grupo inhibidor de la fluorescencia de un grupo fluorïforo F,

- la flecha que sale del ïtomo de oxïgeno directamente soportada por el ciclo fenilo representa el punto de

acoplamiento de dicha subunidad B1 con una unidad sacarïdica del brazo separador, con intermedio de un enlace covalente con el ïtomo de carbono situado en posiciïn 1 anomïrica de dicha unidad sacarïdica,

- la flecha que sale del ïtomo de oxïgeno enlazada al radical -CH2- representa el punto de acoplamiento de dicha subunidad B1 con una subunidad B2, escogida entre los grupos aromïticos de fïrmula (III) siguiente:

en la que:

• Fonc es una funciïn quïmica reactiva con respecto de una funciïn quïmica complementaria de un grupo 40 inhibidor de la fluorescencia del grupo F o bien de un grupo fluorïforo F;

• la flecha representa el punto de acoplamiento de dicha subunidad B2 con la subunidad B1 con intermedio de un enlace covalente con el ïtomo de oxïgeno de la subunidad B1,

• X es O, NH ï S; y

ii) los grupos aromïticos monocïclicos de fïrmula (IV) siguiente:

en la que:

- R1 se escoge entre los grupos nitro, sulfato, amina y amina protegida por un grupo protector,

- la flecha que sale del ïtomo de oxïgeno directamente soportada por el ïtomo de carbono del ciclo fenilo representa el punto de acoplamiento de dicha subunidad B1 con la unidad sacarïdica del brazo separador con intermedio de un enlace covalente con el ïtomo de carbono situado en posiciïn 1 anomïrica de dicha unidad sacarïdica,

- la flecha que sale del ïtomo de oxïgeno enlazado al radical -CH2- representa el punto de acoplamiento de

en la que:

• R2 es un ïtomo de oxïgeno o un radical alquilo en C1-C4,

• Fonc es una funciïn quïmica reactiva con respecto de una funciïn quïmica complementaria de un grupo

fluorïforo F o bien de un grupo inhibidor de la fluorescencia de un grupo fluorïforo F; 15 • m es un nïmero entero de 1 a 10;

• Y es O, NH ï S;

• las flechas que representan el punto de acoplamiento de dicha subunidad B2 con, por una parte, la subunidad B1, y por otra, un ïtomo de nitrïgeno o de oxïgeno soportado por una subunidad B3 de fïrmula

(VI) siguiente: 20

en la que:

• W representa O, NH ï S;

• la flecha representa el punto de acoplamiento del ïtomo de nitrïgeno, de azufre, o de oxïgeno, designado por W con intermedio de un enlace covalente con un ïtomo de carbono de la subunidad B2,

• n es un nïmero entero de 1 a 10;

• Fonc es una funciïn quïmica reactiva con respecto a una funciïn quïmica complementaria de un grupo 30 fluorïforo F o bien de un grupo inhibidor de la fluorescencia de un grupo fluorïforo F.

2. Sustrato, segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado porque las unidades sacarïdicas del esqueleto S son escogidas entre galactosa, manosa, idosa, talosa, ramnosa, glucosa, ribosa, fucosa y sus derivados aminados o ïcidos.

3. Sustrato, segïn la reivindicaciïn 2, caracterizado porque los derivados aminados y ïcidos de las unidades sacarïdicas son escogidos entre la galactosamina, glucosamina, lactosamina, ïcido glucurïnico, ïcido idurïnico y ïcido siïlico.

4. Sustrato, segïn la reivindicaciïn 2 ï 3, caracterizado porque las unidades sacarïdicas del esqueleto S de los 40 sustratos de fïrmula (I) son escogidas entre la glucosamina, galactosa y ïcido glucurïnico.

5. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el esqueleto S es un oligosacïrdio escogido entre los oligosacïridos que tienen de 4 a 9 unidades sacarïdicas.

6. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Fonc se escoge entre las funciones amina primaria y tiol.

7. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las subunidades de fïrmula

(II) son escogidas entre aquellas en las que Fonc estï situada en posiciïn orto del ïtomo de carbono portador del 50 ïtomo de oxïgeno.

8. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las subunidades de fïrmula (III) son escogidas entre aquellas en las que:

- X es un ïtomo de oxïgeno y Fonc es una funciïn amina primaria o tiol,

- X es un ïtomo de nitrïgeno y Fonc es una funciïn amina primaria o tiol.

9. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las subunidades de fïrmula (IV) son escogidas entre aquellas en las que R1 estï situado en posiciïn orto del ïtomo de carbono portador del ïtomo de oxïgeno.

10. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las subunidades de fïrmula (V) son escogidas entre aquellas en las que: 10

-R2 es un radical metilo, m=1, Fonc es una funciïn amina primaria e Y es un ïtomo de oxïgeno,

-R2 es un radical metilo, m=1, Fonc es una funciïn amina primaria e Y=NH.

11. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las subunidades de fïrmula 15 (VI) son escogidas entre aquellas en las que:

-W es un ïtomo de oxïgeno, n=1, Fonc es una funciïn amina primaria e Y es un ïtomo de oxïgeno,

-W representa NH, n=1, Fonc es una funciïn amina primaria e Y es un ïtomo de oxïgeno,

-W es un ïtomo de azufre, n=1, Fonc es una funciïn amina primara e Y es un ïtomo de oxïgeno. 20

12. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se escoge entre los compuestos de fïrmulas (I-1) y (1-2) siguientes:

en las que F, I, Fonc, X, Y, W, R1, R2, m y n tienen las mismas significaciones que las indicadas por las reivindicaciones 1 a 11.

13. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los grupos fluorïforos F son escogidos entre la fluoresceïna y sus derivados; los colorantes fluorescentes absorben y emiten en los infrarrojos prïximos; las cianinas fluorescentes; la 7-hidroxi-9H- (1, 3-dicloro-, 9-dimetilacridina-2-ona) ; la rodamina y sus derivados; colorantes fluorescentes de aminas reactivas; difluoruros de boro de dipirrometeno; porfirinas; cianinas; oxacinas; fluorïforos derivados del pireno; derivados diazoicos, derivados de dansilo; eosina; eritrosina y derivados de sulforrodamina; y nanopartïculas fluorescentes.

14. Sustrato, segïn la reivindicaciïn 13, caracterizado porque el grupo F es escogido entre los grupos fluorïforos F que absorben y emiten dentro de los infrarrojos prïximos.

15. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo I es un grupo 40 fluorescente escogido entre los grupos cuya fluorescencia inhibe la del grupo F.

16. Sustrato, segïn la reivindicaciïn 15, caracterizado porque el grupo I es idïntico al grupo F.

17. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el grupo I es un grupo

fluorescente, diferente del grupo F y que absorbe la fluorescencia del grupo F por transferencia de energïa por resonancia de fluorescencia.

18. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es escogido entre los compuestos de fïrmula (I) es los que:

i) el esqueleto S es una galactosamina, el brazo separador estï constituido por una subunidad B1 de fïrmula (II) y de una subunidad B2 de fïrmula (III) y F e I son idïnticos; ii) el esqueleto S es una galactosamina, el brazo separador estï constituido por una subunidad B1 de fïrmula (IV) , de una subunidad B2 de fïrmula (V) y de una subunidad B3 de fïrmula (VI) y F e I son idïnticos;

iii) el esqueleto S es una galactosamina, el brazo separador estï constituido por una subunidad B1 de fïrmula (IV) y de una subunidad B2 de fïrmula (III) y F e I son diferentes;

19. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque los sustratos enzimïticos de fïrmula (I-1) son escogidos entre los compuestos siguientes: 15

20. Sustrato, segïn cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque los sustratos enzimïticos de 21. Utilizaciïn de, como mïnimo, un sustrato enzimïtico de fïrmula (I) , tal como se ha definido en cualquiera de las 25 reivindicaciones anteriores, a tïtulo de reactivo fluorescente para la detecciïn de actividad enzimïtica in vitro.

22. Utilizaciïn de, como mïnimo, un sustrato enzimïtico de fïrmula (I) , tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y en el que el grupo fluorïforo F es escogido entre los grupos que absorben y emiten en los infrarrojos prïximos, para la preparaciïn de un reactivo de diagnïstico destinado a la formaciïn de imïgenes funcional in vivo.

23. Utilizaciïn, segïn la reivindicaciïn 22, caracterizada porque dicho reactivo estï destinado a formaciïn de imïgenes, por fluorescencia, de la expresiïn de los genes informadores LacZ y gusA de E.coli.

24. Reactivo de diagnïstico, caracterizado porque comprende, como mïnimo, una soluciïn constituida por agua o una mezcla de agua y, como mïnimo, un disolvente orgïnico, comprendiendo dicha soluciïn, como mïnimo, un sustrato enzimïtico de fïrmula (I) , tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

25. Reactivo, segïn la reivindicaciïn 24, caracterizado porque se trata de un reactivo de diagnïstico in vivo y que el

sustrato enzimïtico de fïrmula (I) comprende, como mïnimo, un grupo fluorïforo F escogido entre los grupos fluorïforos que absorben y emiten en los infrarrojos prïximos.

26. Reactivo, segïn la reivindicaciïn 24 ï 25, caracterizado porque la concentraciïn del o de los sustratos enzimïticos de fïrmula (I) estï comprendida entre 1 ïM y 1 mM.